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1、SSR标记分离技术的研究概况第27卷第6期2007年12月咸宁学院JournalofXianningCoHegeVo1.27,No.6Dec.2007文章编号:1006—5342(2007)06—0080—05SSR标记分离技术的研究概况刘卫东(成宁学院化学与生命科学系,湖北成宁437100)摘要:SSR标记是植物中目前运用的最广泛的分子标记之一,广泛地运用于植物种质鉴定,分子标记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域.由于SSR为共显性标记,可以区分纯合,杂合基因型,因而得到更广泛的应用.目前出现了有筛选文库,筛选富集文库,与其他现有技术结合,ST
2、MP技术等SSR标记方法.在这些技术中,目前运用最广泛而且比较成熟的方法是筛选富集文库的方法,STMP技术是目前效率最高的分离单个微卫星位点的方法,可以开发SSR标记.本文对这些技术的原理作了论述.关键词:SSR标记;分离技术;单位点;原理中图分类号:s512.1文献标识码:A简单序列重复(simplesequencerepeats,简称SSRs)或微卫星(microsatellite)序列大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中,由串联的1—6bp核苷酸重复片段构成,长度一般在100bp以下,具有长度的超变性(hype
3、rvariabili~)¨J.Taut等1989年报道了SsR标记技术,阐明了微卫星序列作为遗传标记的可行性,价值.其原理是:与微卫星序列相邻的两侧区域保守性通常较高,可以在此保守区域设计一对特异的PCR引物,扩增其中的微卫星序列,通过聚丙酰胺凝胶电泳,即可显示出个体间在此位点的微卫星序列的多态性….与其他分子标记如:如RAPD,RFLP等相比,SSR标记具有以下的优点:(1)在植物基因组中大量地,随机地分布,具有广泛的位点变异,揭示比RAPD,RFLP更多的多态性J.(2)SSR标记揭示的是单个位点上复等位基因的信息,为共显性标记,能够区分纯合
4、型和杂合型,提供完整的遗传信息.(3)微卫星序列多态性可以用PCR方法检测,不需要过多的分子克隆手段,对DNA模板的要求不高,重复性好J.因此成为在植物中目前运用最广泛的分子标记之一,广泛地运用于植物种质鉴定.6J,分子标记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域.但是微卫星收稿日期:2007一o5一o8标记存在一个重要的局限性就是微卫星序列两侧区域在种间保守性往往较低.种间扩增微卫星标记仅仅局限于同一个属或相近的属的不同物种间的扩增,这大大限制了SSR标记在其他物种中的运用¨...现在有一些从微卫星序列衍生而来的其他分子标记,不用分离单个微卫星位点而
5、获得多个位点指纹图谱,如ISSRs(inter—simplese—qtmcerepeats)㈨,RAMP(randomamplifiedmicro.satellite)㈤,eopia—SSRt引,SAMPL(selectivelyamplifiedmicrosattelliteloci)¨等,但由于多位点微卫星指纹图谱带型复杂,难以确定等位基因,大多为显性标记,这限制了它们的运用的范围¨.分离单个位点微卫星序列,从而获得共显性SSR分子标记成为许多研究工作者的目标,现将SSR分离技术介绍如下:1从基因组或eDNA文库中筛选SSR传统用于克隆单位点
6、微卫星序列的方法包括以下步骤:(1)构建小片段或大片段的基因组或eDNA文库.(2)筛选阳性克隆.通过传统的影印或挑单菌落点膜的方法,把克隆转移到尼龙膜上,经过固定后,用标记过的序列重复寡核苷酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交,筛选出其中的阳性克隆.(3)测序,设计引物,优化PCR第6期刘卫=东SSR标记分离技术的研究概况8l反应条件.获得的阳性克隆经过确认后,全部或经过随机挑选后测序,然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物,优化PCR扩增的条件,获得稳定,可靠的SSR标记.2构建富集微卫星序列的基因组文库构建富集微卫星序列的基因
7、组文库是现在分离单微卫星位点的主要方法,它与传统方法不同在于有一个富集微卫星序列的步骤,按照富集方法的不同,主要有两种方法:(1)引物延伸反应富集微卫星序列它的大致步骤为:首先建立以噬菌粒(phage—mid)或M13噬菌体为载体的小片段基因组文库,这种文库叫初级文库(primarylibrary).然后用辅助噬菌体(helperphage)超感染(superinfecting)初级文库,产生单链环状DNA,以单链DNA为摸板,用微卫星序列为引物合成双链DNA,然后富集双链DNA'l.其主要步骤如下:1)经酶切的基因组DNA与噬菌粒pBluesc
8、riptKS(+)相连,连接产物转化dut—ung一大肠杆菌菌株,构建初级文库.在这种菌株里由于缺乏dUT—Pase和UDG(尿嘧啶一D
