宫环止血片对人子宫内膜细胞影响的分子机制研究

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1、模型子宫内膜显微形态学变化、内膜局部一氧化氮、前列环素、血栓素、纤溶酶原激活物及抑制物含量变化，血管内皮细胞分泌活性因子等方面有影响作用。但从子宫内膜细胞外基质合成和降解途径研究药物的效应目前尚不完善，本研究观察宫环止血片对子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中ＭＭＰ。ｌｍＲＮＡ、ＴＩＭＰ．１ｍＲＮＡ的表达，进一步明确宫环止血片的治疗机制，为・临床应用提供科学依据。实验部分一、实验材料１．试剂及仪器１．１药品和试剂培养液：ＲＰＭＩ一１６４０干粉培养基（美国ＨＹｃＬｏＮＥ公司产品，按说明配置，加入适量碳酸氢钠将ＰＨ值调至７．４，加青霉素ｌＯＯＵ／ｍｌ、链霉素１００１ｘｇ／ｍｌ，过滤除菌

2、后分装，－２０。Ｃｆｆｔ存）；标准胎牛血清（中国医学科学院）；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ配成０．２５％浓度，以ｏ．２２Ｄｘｍ微孔滤膜注射器加压过滤除菌，分装冻存）；注射用两性霉素Ｂ（上海先锋药业）、注射用青霉素钠（四川制药）、注射用硫酸链霉素（华北制药）、Ｐｏｌｙ－１－ｌｙｓｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ）、ＴＢｓ缓冲液（博士德）、ｏ．１Ｍ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ缓冲液，武汉博士德）。。１．２主要设备及器材Ｃ０２孵箱（德国贺利氏Ｈｅｒａｃｅｌｌ）、电子天平ＡＧ２０４型（瑞士）、ＯＰＴＯＮ万能光学显微镜（西德）、ＨＨ．Ｗ三用恒温水浴箱、超净工作台（苏州ＳＷ－ＣＪ．２ＦＤ）、ＳＫＧ．０１电热恒温

3、干燥箱、ＴＤＺ５一ＷＳ台式多管自动平衡离心机、ＣＲＤＸ。２８０电垫手提式灭菌消毒器、ＰＣＲ扩增仪（ＵＳＡ）、５０ｍｌ培养瓶、刻度吸管、试管、离心管、培养皿、９６孔培养板等。１．３检测试剂（１）逆转录试剂盒（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。（２）ＴＲＩｚ０１试剂（美国ＧＩＢｃ０公司）。（３）ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、１０ｘｂｕｆｆｅｒ等ＰＣＲ，反应试剂、琼脂糖ｆ上海生工生物工程技术服务有限公司ｏ（４）ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（１００ｂｐｌａｄｄｅｒ）。（５）ＤＥＰｃ（美国ｓｉｇｍａ公司），Ｄ—Ｈａｎｋｓ＇Ｗｋ（美ＧＩＢｃｏ公司），ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ、硼酸（Ｐｒ

4、ｏｍｅ黟公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇（国产）。（６）鼠抗人基质金属蛋白酶１（ＭＭＰ一１）单克隆抗体（北京中山生物工程有限公司，为美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ＆司产品１。（７）鼠抗人金属蛋白酶组织抑制因子１（ＴＩＭＰ一１）单克隆抗体ｆ北京中山生物工程有限公司，为美／訇ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品）。（８）ｓＰ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）免疫组化试剂盒（北京中山生物工程有限公司）。（９）ＤＡＢ显色试剂盒（武汉博士德）、Ｍａｙｏｒ，苏－木素（ＳＩＧＭＡ）、０，０１Ｍ枸橼酸盐缓冲液、无水乙醇等。２．诱导剂和施加药物２．１诱导剂：细菌脂多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａ

5、ｒｉｄｅ，ＬＰＳＳＩＧＭＡ公司０１２７：Ｂ８）溶于ＲＰＭｌｌ６４０（含胎牛血清１０％）的培养液中，用０．２２１ａｍ滤膜加压过滤除菌，置４。Ｃ过夜备用。２．２施加药物宫环止血片浸膏，湖南省药品研究服务中心提供，批号２００１０３０２，吲哚美辛肠溶片，２５ｍｇ／）：｝，镇江吉贝尔药业有限公司生产。含药血清的制备：大鼠１２只，全部雌性。随机分两组，分别给以宫环止血片和吲哚美辛灌胃。灌胃剂量如下：２００９大鼠体表面积Ｓ＝３１１．２ｃｍ２，体表面积系数为：０．００２４，按每ｋｇｉ９４．Ｏｍｌ。宫环止血片浸膏每克含９．８９生药，人每日３．３６６９浸膏。ｌｋｇ大鼠所用剂量＝３．３３６９ｘ

6、０．００２４＋０．２＝０．０４０３９２９／ｄ，由此０．０４０３９２＋４．Ｏｍｌ＝Ｏ．０１００９８９／ｍｌ吲哚美辛２５ｍｇ／片，人所需剂量为７５ｍｇ／ｄ。ｌｋｇ大鼠剂量＝ｏ．０７５ｘ０．００２４＋０．２＝０．０００９每天每埏体重量需Ｏ．０００９９，ｏ．０００９＋４得出，每ｍ１含量为ｏ．０００２２５９。按剂量配制连续灌胃３ｄ，末次给药后１ｈ，清醒状态下颈动脉分离插管采血，同组血清混合经Ｏ．２２ｐｍ微孔滤膜过滤后，５６。Ｃ、３０ｍｉｎ水浴灭活处理，一２０。Ｃ保存备用［１１】［１２１。不同浓度药物的配制：将经灭活处理后的舍药血清加入培养液，分别配制成含宫环止血片２．５％，５％，１０％

7、，２０％，４０％不同浓度的含药血清；和含吲哚美辛２．５％，５％，１０％，２０％，４０％不同浓度的含药血清。并设正常血清对照组分别含标准胎牛血清２．５％，５％，１０％，２０％，４０％不同浓度，及无血清空白对照组，４。Ｃ保存备用。二、实验方法１．标本来源组织标本均来自于湖南省妇幼保健院门诊诊刮病人，患者年龄２５～４０岁，３个月内未服用任何激素类药物，如避孕药、氟灭酸等影响内分泌的药物。刮取临床肝郁型患者月经周期第１天出血１２ｈ内的标本。全过程均在无菌条件下完成，子宫内膜标本用灭菌的冷生理盐水反复冲洗，除去血