大肠感触感染态制备

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5、各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA转化；（3）

6、适量的溶菌酶能提高转化率。2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322质粒DNA对E·coliK——12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0

7、的100mmol/LCaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。（二）重组DNA的转化原理我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA分子在受体