鸡源鹦鹉热衣原体momp基因重组腺病毒的稳定性及spf雏鸡免疫试验论文

《鸡源鹦鹉热衣原体momp基因重组腺病毒的稳定性及spf雏鸡免疫试验论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的稳定性及SPF雏鸡免疫试验论文【关键词】衣原体,鹦鹉MOMP；重组,遗传；腺病毒科；中和试验；雏鸡免疫StabilitytestandSPFchickimmunetestofrebinantadenoviruscontainingmajoroutermembraneproteinofChlamydiapsittaciofchickenorigin【Abstract】AIM:Todetectthestabilityoftherebinantadenovirusplasmidcontainingm

2、ajoroutermembraneprotein(MOMP)genefromChlamydiapsittaciinHEK293cells,toevaluateofEggDropSymdrome(EDS),andtoevaluateidsixedofEDSinvitroandtheninfectedHEK293cells.TheSPFchicksidcouldbeamplifiedbyPCRindifferentpassagesofHEK293cells.ThereofEDS.90%oftheSPFchicksvaccinatedid

3、canbepassagedstablyinHEK293cells.TherebinantadenoviruscannotreactofEDS.TheSPFchicksinoculatedydophilophilapsittaciMOMP;rebination,geic;adenoviridae;neutralizationtests;chicksimmunity【摘要】目的：检测重组腺病毒质粒在HEK293细胞中的稳定性；重组腺病毒是否与减蛋综合征阳性血清发生中和反应，以及用重组腺病毒免疫SPF小鸡是否产生保护.方法：将重组腺病毒质

4、粒在HEK293细胞中连续传代，并用PCR法检测目的基因；用减蛋综合征阳性血清在体外中和重组腺病毒，接种HEK293细胞；用重组腺病毒免疫SPF小鸡，然后用CpL菌株攻击.结果：重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代后，仍然用PCR检测能检测出目的基因；重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清之间无交叉反应；用重组腺病毒免疫SPF鸡，用CpL菌株攻击，90%的小鸡获得了保护.结论：重组腺病毒质粒在HEK293细胞中能稳定传代；重组腺病毒不受减蛋综合征阳性血清的影响；用重组腺病毒免疫SPF小鸡.freelL，进行10-1,10-2……10-

5、11系列稀释.将购买的减蛋综合征阳性血清置56℃水浴中，灭活30min.取稀释的重组腺病毒HEK293细胞液100μL，加入灭活的减蛋综合征阳性血清100μL,37℃作用1h.将中和液加入到已长满的HEK293细胞单层，37℃,50mL/L的CO2条件下培养，观察结果.同时作对照.1.2.2重组腺病毒稳定性试验将重组腺病毒连续传代20代以上，观察并记录细胞病变时间.取第5代、第10代、第15代、第20代病变细胞，反复冻融3次.取1mL的冻融液，加入50μL100g/LSDS和3μL（20μg/μL）,60℃作用30min，然后置37

6、℃作用2h.提取腺病毒基因组DNA，进行PCR检测.1.2.3重组腺病毒电镜观察取于36h内病变的细胞，反复冻融3次，取2mL3000r/min离心30min，除去细胞碎片.将磷钨酸配置成20g/L的溶液，以1mol/L的氢氧化钠调整pH为6.8，滤过后盖紧瓶盖，4℃保存.将染液与病毒液等量混合后，在无菌柜或防尘罩内用喷雾器将样品喷到带膜的载网上，待干燥后进行电镜观察.1.2.4重组腺病毒制备免疫用重组腺病毒AdMOMP为第21代毒，其毒价为3.4×1013TCID50/L.收集于30h内病变的HEK293细胞，用PBS重悬，反复冻

7、融3次，6000r/min离心30min，收取上清，直接用于小鸡免疫.空白对照HEK293细胞悬液、野生型腺病毒Ad5的制备方法同上.1.2.5CpL鸡胚适应毒CpL菌株在7d龄鸡胚测定其毒力，毒力为2.8×1011.1.2.6试验动物及分组试验动物为7日龄SPF雏鸡，共60只，分重组腺病毒组、野生型腺病毒组、HEK293细胞组，经翅根肌肉和皮下两个途径进行接种，每组10只，接种量分别为：7.7×109TCID50,4×108TCID50和0.4mL.1.2.7血清抗体效价测定于接种前1日和免疫后15d，分别于试验鸡翅根部静脉采血，

8、用衣原体间接血凝（IHA）试验检测血清衣原体抗体.操作步骤如下：取经处理过的干净的96孔V型板，每孔加入25μL的稀释液.取25μL自然析出的血清，加入到第一孔中，混匀，吸取25μL，加入到下一孔，如此对倍稀释，直至第7孔，混匀后吸弃