整合素β3与汉坦病毒囊膜糖蛋白在rrs系统中的相互作用

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1、整合素β3与汉坦病毒囊膜糖蛋白在RRS系统中的相互作用【关键词】汉坦病毒;整合素β3;酵母双杂交;Ras救活系统(RRS)　　汉坦病毒主要引起两种急性传染性疾病,即肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）。我国是世界上HFRS疫情最为严重的国家,主要流行的病毒型别是汉滩病毒（Hantaanvirus,HTNV）和汉城病毒（Seoulvirus,SEOV）。1998年Gavrilovskaya等［1］研究发现,汉坦病毒的受体是αvβ3。虽然汉坦病毒可以感染多种细胞系,其入胞机制尚未完全阐明,而且后续研究发现汉坦病毒还可以通过DAF/CD55［2］、gC1qR/p32［3］等多种分

2、子进入细胞。但是,αvβ3仍被认为是汉坦病毒主要受体之一,可与汉坦病毒囊膜糖蛋白G1/G2构成的病毒受体连接蛋白（VAP）相互作用。然而,VAP究竟如何与αvβ3分子结合尚不完全清楚。　　Ras救活系统（Rasrecruitmentsystem,RRS）是一种新型酵母双杂交系统,该系统利用蛋白间相互作用,使Ras蛋白在包膜上激活腺苷酸环化途径,从而使酵母温度敏感突变株cdc252得以在36℃存活生长。该系统可用于膜蛋白分子间相互作用的研究。因此,我们尝试利用该系统初步鉴定汉坦病毒囊膜糖蛋白G1和G2与人整合素β3是否存在相互作用,为揭示汉坦病毒囊膜糖蛋白与受体识别结合的机制奠定基础。　　1

3、材料和方法　　1.1材料　　cdc252为酵母温度敏感突变株,基因型为ura3、lys2、leu2、trp1、his△200、ade2101和cdc252。在24～25℃培养于YPD培养基,36℃不能存活,由Ami博士惠赠［4］;E.coliJM109购自Promega公司。HTNV毒株:汉滩病毒76118国际标准株（F1M15）,由宋干教授惠赠。该病毒经乳鼠脑内连续传代增毒至TCID50为10-5。RRS酵母双杂交系统由Ami博士惠赠［4］,该系统包括以下载体:a、ADNSJZRa;b、pYesMJDP2s,a和b可相互作用,为阳性对照;c、pYesRas(61)△F可用于诱饵

4、蛋白基因的克隆,且所表达的蛋白为与Ras基因融合;d、pMet25为酵母表达载体,用于诱饵蛋白融合表达;e、pYesM△PolyA用于猎物蛋白的构建及表达;f、pYes2为空载体对照。上述RRS系统可用于酵母中膜蛋白相互作用的研究。MetG1［5］为含HTNV76118株囊膜糖蛋白G1的重组质粒;MetG2［6］为含HTNV76118株囊膜糖蛋白G2的重组质粒。β3pYesM△PolyA［7］为含有人整合素β3包膜外区基因的酵母双杂交质粒。上述质粒均采用QIAGENPlasmidMidiandMaxiKits制备,紫外分光光度计定量。　　1.2方法　　1.2.1整合素β3在酵母细胞

5、中的表达　　（1）转化与表达:取5μgβ3pYesM△PolyA与10μL鲑鱼精DNA（Sigma）混匀,加入200μL酵母感受菌充分混匀,重悬于1.2mLLIPEG［400g/LPEG（Mr3350）,100mmol/LLiAcTE］中,室温振荡30min,加入100μLDMSO,温和倒置混匀。42℃热休克10min,沉淀重悬于150μL1mol/L山梨醇,涂Ynb（Ura-）平板,24℃培养3～5d后,挑取2个菌落到Ynb（Ura-）培养液,24℃振荡培养2d。（2）蛋白样品制备:取3mL菌液离心集菌,加入1mL用冰预冷的50mmol/LTrisCl(pH8.0),离心洗涤1次。以

6、100μL酵母裂解缓冲液重悬酵母菌［50mmol/LTrisHCl,10mL/LTritonX100,5g/LSDS］,加入0.2g酸洗玻璃珠。剧烈振荡悬液5min×5次。加入50μL5×蛋白电泳上样缓冲液,煮沸10min。13000r/min4℃离心5min,收集上清于另一离心管中。同时制备cdc252阴性对照。　　1.2.2iluminescentSubstrate（PIERCE）增强化学发光底物显影,感光胶片压片5min。　　1.2.3整合素β3与G1、G2糖蛋白相互作用的检测　　根据表1按照上述方法将每组两种质粒各取5μL,共转化到cdc252酵母菌中,涂Ynb+met;0.

7、85gYnb,2.5g硫酸铵,10g葡萄糖,20g琼脂粉,Try、Lys、Ade、His（各50μg/L）,200μg/LMet］平板,24℃培养3～5d。转种到Gal+met;0.85gYnb,2.5g硫酸铵,15gD半乳糖,10gD棉籽糖,10mL甘油,20g琼脂粉,Try、Lys、Ade、His（各50μg/L）,200μg/LMet］平板和Galmet（同Gal+met,但不含Met）平板,36