生物可降解的热敏性壳聚糖接枝n-(乙烯基己内酰胺)纳米粒子作为5-氟尿嘧啶药物载体的合成和研究

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1、生物可降解的热敏性壳聚糖接枝N-(乙烯基己内酰胺)纳米粒子作为5-氟尿嘧啶药物载体的合成和研究摘要：我们合成了具有纳米结构的5-FU(5-氟尿嘧啶)，利用可生物降解的热敏性壳聚糖接枝N-(乙烯基己内酰胺)生物高分子复合物为载体，将5-FU运送到癌细胞内。利用离子交联法制备了这一热敏性接枝共聚合纳米粒子（TRC-NPs），实验结果显示，其在38℃有一个低临界溶解温度。用交联反应将5-FU药物负载到载体上。体外释药实验表明，在低临界溶解温度以上，药物可明显释放出来。细胞毒试验表明，在100-1000微克/毫升的浓度范围内TRC-NPs对

2、一系列细胞无毒理反应，载药纳米微粒对癌细胞的毒性相对较高，而对正常细胞毒性相对较小。加入若丹明-123染料的细胞里出现绿色荧光，这表明细胞已经吸收了5-FU负载热敏性聚合物纳米粒子（5-FU-TRC-NPs）。细胞凋亡检测试验显示，与正常细胞相比，用5-FU治疗时，癌细胞的凋亡增加。这些结果表明，5-FU-TRC-NPs作为抗癌药物，有广阔的应用前景。关键词：热敏性接枝共聚合纳米粒子；低临界溶解温度；生物材料；抗癌药物1.前言在癌症治疗方面，常用的方法是将药物装入一个热敏性生物可相容的胶囊里，通过血液循环将药物输送到肿瘤部位。甲壳素

3、和壳聚糖是生物相容性、生物可降解并且无毒的高分子化合物。基于这些特性，其在组织工程、创伤修复、药物输送和基因传递方面应用广泛。近年来，人们更多地着眼于水溶性刺激的反应上。研究显示，聚合物系统在应对外部刺激，如温度、PH值、特定的离子和电场时存在阶段过渡状态。在所有的智能高分子的研究中，温度和PH对聚合物的影响备受关注，因为它们是重要的人体生理因素，一些疾病就是因温度或PH或两者的同时变化而引起的。最近，一些研究小组报道了他们利用聚（N-异丙基丙烯酸铵）为基体制备出对温度和PH有感应性的高分子化合物，将其应用于生物医学领域。聚（N-异

4、丙基丙烯酸铵）（PNVCL）是另一种热敏性高聚物，其实际的应用价值体现在它的热敏性、生物相容性和络合能力上，NVCL及其聚合物仅仅应用于化妆品工业生产中，目前还没有报道将纳米结构高聚物和抗癌药物相结合的研究。5-FU，一种嘧啶类化合物，可通过干扰胸甘酸的合成来抑制肿瘤细胞的活性。它的不足之处是：快速代谢造成生物半衰期短；因二氢嘧啶脱氢酶的作用，代谢迅速，而使口服吸收不完整；对健康细胞无选择性。为了延长5-FU的作用时间，提高其疗效，所以将其载入到纳米颗粒载体，以减少5-FU的副作用，从而提高其治疗指数。5-FU这类疏水性药物，在进入

5、循环系统后会迅速脱离载体而重新分布，与相应的无载体的药物相比更能提高和完善药物的代谢。但是我们所需的治疗肿瘤的药剂要有高度的稳定性，只有温度达到聚合物的最低临界温度时，热敏性的壳聚糖-g-纳米粒子才在靶向癌细胞上释放出来。这种方法使得开发这种热敏性的智能材料成为可能。本文中，我们通过研究集合物载体的低临界溶解温度，介绍了针对输送5-FU药物的智能材料的合成。这种热敏性聚合物纳米材料最重要的优势是它因与可生物相容的壳聚糖基团共轭而有高度可调性和生物降解性。本文中，我们系统研究了5-FU-TRC-NPs的纳米结构、化学稳定性、体外细胞摄

6、取、以及细胞毒作用。2.实验部分2.1合成羧基终止的聚(N-乙烯己内酰胺)(PNVCL–COOH)在异丙醇溶液中采用自由基聚合方法合成PNVCL-COOH。依次将N-乙烯己内酰胺(NVCL)（使用之前用己烷进行重结晶），巯基丙酸（MPA），偶氮二异丁腈(AIBN)(Sigma–Aldrich)溶解在100ml的异丙醇溶液中(MerkCompanyCochin)。在聚合之前先通氮气15min，在75℃下用惰性气体保护反应6小时。反应之后，产物用过量的乙醚进行萃取，然后进行真空干燥。其后，用30ml密理博水进行溶解。在纤维素膜试管中（能

7、拦截1000Da的微粒）用蒸馏水透析三天来除去杂质及未反应的原料。最后在0.085mbar压力和-85℃温度下对产品进行结晶，方便以后的研究。2.2合成壳聚糖接枝聚(N-乙烯己内酰胺)（chitosan-g-PNVCL)常温下，使用EDC/NHS（1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺碘甲烷盐）作为冷凝剂把PNVCL–COOH嫁接到壳聚糖上。首先，一边搅拌一边把壳聚糖溶液滴加到1%的醋酸溶液中。就这样，将PNVCL–COOH水溶液配制好（在密理博水中）。然后，将EDC/NHS（比例：1：2）溶液慢慢地加到混合物中。低转速下常温反

8、应12h。用纤维素膜试管透析三天，后将产品冷冻干燥。2.3空白TRC-NPs的合成将壳聚糖接枝聚合物（1：9的聚合比例）溶解在乙酸中（1%的溶液）并且最后的溶液与磷酸三苯脂以1：1进行交叉结合。将最后的纳米可降解物在30000rpm转