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1、小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定论文田蓉,李巍,于继云,刘玉峰【关键词】树突细胞Invitrocultureandcharacterizationofmousespleendendriticcells【Abstract】AIM:Toexploreandoptimizethemethodsforinvitrocultureofmousedendriticcells(DC)thatorphologicallyandidentifiedbiologically.METHODS:Miceg/kgcyclophosphamidethroug
2、hthetailvein,andethodsfirstly,and3dlaterconditionalmediumcontainingIL4,GMCSFicroscope,scanningelectronmicroscope,andtransmissionelectronmicroscopeanalysis.Atday3,5,7,cellsarkers.RESULTS:CulturedcellsdisplayedatypicalDCphenotypeinmorphologicalanalysis,andFACSshoarkers
3、asCD11c,CD86,.freelulatorsinthemousespleencellculturecanobtainDCakesafoundationforfutureresearchonthebasicandclinicalusageofDC.【Keyolecule【摘要】目的:探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞(DC)的方法,并进行形态学观察和生物学鉴定.方法:应用环磷酰胺200mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠,8d后处死小鼠,常规培养脾细胞,第3日加入含有IL4,GMCSF细胞因子的条件培养液.freel
4、an等于1973年发现树突状细胞(dentriticcell,DC)以来[1],DC作为体内最重要的抗原提呈细胞,其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力,日益引起国内外学者的关注.特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能,使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域.DC来源于骨髓CD34+细胞[2],获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键,然而DC在体内分布散在,含量极低,在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%.目前体外培养DC的方法尚不尽人意,在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展.我们在体外培
5、养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞,在培养中添加IL4,GMCSF,TNF等刺激,并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定,为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.1材料和方法1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司;荧光标记抗体:CD11cFITC,IAbFITC,H2DbFITC,CD86FITC购自Diaclone公司;rmGMCSF,rmIL4,TNFγ,胎牛血清,DMEM培养基,胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司;Hepes,青霉素,链霉素购自美国Sigma公司;倒置相差显微镜为日本Olympus公司
6、生产,低速离心机为北京医用离心机厂生产,微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产,流式细胞仪为Coulter公司生产,扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产;6~8g/kg体质量由小鼠尾静脉注射,8d后颈椎脱位处死小鼠,750mL/L乙醇浸泡10min,无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上,剔除脾周围的结缔组织,剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液,离心800r/min,7min,加TrisNH4Cl3mL,溶除红细胞,获取细胞悬液,以完全培养基悬浮为1×109/L细胞,37℃,50mL/LCO2孵箱培养.3d后,
7、吸弃全部培养基及悬浮细胞,加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液,第5d补加细胞因子TNFγ1mg/L,第7d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体,次日收集悬浮的细胞即为富集的DC.相差显微镜下观察细胞形态特点.1.2.2扫描电镜观察取如上培养7d的细胞悬液,接种放置在培养皿中的盖玻片上,37℃,50mL/LCO2孵箱培养.待细胞汇合,取出盖片,浸入PBS漂洗细胞表面;将细胞铺片放入青霉素小瓶中,加4℃预冷的40mL/L戊二醛,在4℃固定2h,吸出固定剂,PBS浸洗2次,每次10min,再用4℃预冷的10g/L锇酸固定,
8、在4℃固定1h,然后用PBS浸洗2次,每次10min;用系列梯度乙醇脱水,乙酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,扫描电镜观察细胞表面结构.1.2.3透射电镜观察取如上培养7d的细胞悬液,PBS洗涤,细胞沉淀用40mL/L戊二醛固定,梯度乙醇脱水,包埋,经超薄切片铅铀