早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响

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1、早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响【摘要】目的研究早期干预对宫内感染致脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞原位增殖能力的影响。方法30只孕17d大鼠连续2d腹腔注射脂多糖(450μg/kg)，设为脂多糖组,制备宫内感染脑损伤动物模型，生理盐水组6只注射等量生理盐水。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组和训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。对训练组进行早期干预至日龄28d,对照组、损伤组常规饲养;选取1，3，7，14，28d各组仔鼠用免疫组织化学方法动态检测海马齿状回颗粒层，BrdU阳性细胞的表达。结果(1)出生后1d对照组、训

2、练组、损伤组新生大鼠海马齿状回颗粒层均存在BrdU，对照组显著高于训练组、损伤组(P<0.01)。(2)对照组BrdU阳性细胞数3d开始增加，7d达到高峰，14d后下降，28d接近正常成年大鼠水平。(3)早期丰富环境刺激后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层BrdU阳性细胞数在3d开始增加，14d达高峰，峰值显著高于对照组水平(P<0.01)，28d后下降，但仍高于对照组，BrdU阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。结论宫内感染致大鼠脑损伤可导致内源性神经干细胞增殖能力降低，并较长时间内难以自然恢复;早期干预可激活脑损伤鼠内源性神经干细胞原位增殖能力，推迟高峰出

3、现，延长作用“时间窗”。【关键词】脑损伤;宫内感染;神经胶质增生;干预;大鼠;动物，实验　　【Abstract】ObjectiveTostudytheimpactofearlyinterventiononproliferationofneuralstemcellsinbraindamageratsafterintrauterineinfection.MethodsTotally36A公司)。5BrdU免疫组织化学试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。　　1.2动物模型制备与分组运用李晓捷等[3]所建的宫内感染致脑损伤动物模型，将研究对象常规饲养,饮食自由,明暗周期12

4、h/12h,室温(18±3)℃。于下午17时以2∶1合笼,次日上午8时查阴道涂片,查到精子记为妊娠0d,孕鼠另笼饲养。随机数字表法选取孕鼠分为脂多糖组30只和生理盐水组6只。脂多糖组孕17d大鼠连续2d腹腔注射脂多糖,剂量为每次450μg/kg;生理盐水组大鼠腹腔注射等量生理盐水。观察两组大鼠的分娩时间,孕22d前分娩的仔鼠为早产鼠,去除早产鼠。仔鼠出生后，取胎盘做苏木精伊红染色观察宫内感染情况。　　将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组、训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。设生后1，3，7，14，28d5个时间点，每个时间点6只，测定Brd

5、U水平变化，进一步分析探讨早期干预对脑损伤内源性NSCs增殖能力的影响机制。　　1.3早期干预方法　　1.3.1早期触摸在仔鼠出生后2～13d，每日将训练组仔鼠与母鼠分开1次，用毛刷从头至尾沿脊柱轻轻地摩擦，持续15min。　　1.3.2早期丰富环境早期触摸第7天始，给予训练组仔鼠丰富环境刺激，参照国内外文献设计[4，5]，在70cm×60cm×50cm的大笼内放置不同颜色、形状及气味的物体。包括各种质感的砂纸、毛刷，冰冷的金属和有刺激性气味的柠檬、薄荷棉球。还有转盘、管道、斜坡、秋千、跷跷板、小球等“玩具”，并配以舒缓的轻音乐。训练组仔鼠每日放入笼内4次，每次10m

6、in，每周将环境改变2次，以造成新异的刺激，总干预时间为21d。　　对照组和损伤组分别饲养于20cm×30cm×45cm标准笼内，不予早期干预。　　1.4BrdU标记和染色　　1.4.1BrdU标记BrdU溶于0.01%磷酸盐缓冲液，50mg/kg腹腔注射，共分2次，间隔6h。术后1d麻醉后处死。剥离头皮，沿前囟剪开颅骨，取出大脑，将其泡置于40g/L多聚甲醛(4℃)，固定，常规脱水，石蜡包埋，切片从视交叉冠状面到海马，片厚5μm，每5张取1张，每标本取10μm，行BrdU免疫组织化学染色。　　1.4.2BrdU免疫组织化学染色首先用50%甲酰胺和柠檬酸钠在65℃下处

7、理脑组织切片2h，行DNA变性;3%过氧化氢，室温5～10min以灭活内源性酶;滴加正常山羊血清工作液，加小鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶100倍)，室温，孵育2～3h;加生物化二抗(生物素化山羊抗兔IgG);加过辣根酶链霉卵白素工作液，室温孵育10～15min;磷酸盐缓冲液冲洗;联苯胺染色，苏木精复染。　　1.5BrdU免疫组织化学结果判定光镜(10×20)下以细胞核内有棕褐色或棕黄色颗粒且密度不均者为BrdU阳性细胞，观察阳性细胞在脑内分布情况;在显微镜400倍视野下计数阳性细胞,共计数5个视野,取其平均值。　　计算机图像分析系统软件(Imagem