核因子nfκb对帕金森病mptp模型小鼠黑质cox2表达的影响论文

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　　核因子NFκB对帕金森病MPTP模型小鼠黑质COX2表达的影响论文【摘要】目的:研究核因子（NFκB）在1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致小鼠帕金森病(PD)模型中的影响和对环氧合酶2(COX2)的表达调控作用以及人参皂甙Rg1对其的影响，探讨导致多巴胺(DA)能神经元变性失活的可能机制.方法:采用MPTP制备亚急性PD小鼠模型,用免疫组织化学法和免疫蛋白印迹法观察小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH),COX2，前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）以及NFκB的表达变化；并观察给予人参皂甙Rg1对上述变化的影响.结果:与对照组小鼠相比,模型组小鼠出现典型PD症状,在MPTP第5次注射后24h，黑质区NFκB（34.6±5.6），COX2（28.2±5.1）,PGE2(36.1±4.2)阳性细胞较对照组NFκB（2.5±0.8），COX2（1.0±0.3）,PGE2(3.2±0.4)阳性细胞显著增加(P0.01),TH阳性神经元显著丢失60%(P0.01)；经人参皂甙Rg1处理后,模型组小鼠PD症状减轻,与模型组比较,.freelethyl4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine,MPTP）制备亚急性PD模型,观察模型动物中脑黑质NFκB和COX2及其产物前列腺素E2（prostaglandine2，PGE2）表达与小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)阳性神经元数量关系及给予人参皂甙Rg1后对上述变化的影响,探讨NFκB在PD发病过程中的分子机制，为探索PD有效防治措施提供线索.1材料和方法1.1材料健康雄性C57BL/6N小鼠45只，8~12a公司)；兔抗人PGE2mAb(美国Cayman公司)；小鼠抗人THmAb(美国Chemicon公司)；人参皂甙Rg1（吉林大学基础医学院化学教研中心）；兔抗人COX2mAb,兔抗人NFκB（p50）多克隆抗体,浓缩型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒(福州迈新生物).1.2方法1.2.1动物分组和模型制备实验随机将小鼠分为3组，每组15只.模型组(PD组)：给予MPTP30mg/kg,盐水溶，腹腔注射,1次/d,连续5d.人参皂甙Rg1干预组(Rg1组)：除给予PD组相同的MPTP处理外,MPTP注射前3d定时给予人参皂甙Rg110mg/kg,盐水溶，腹腔注射，并在MPTP注射前2h注射人参皂甙Rg1.溶剂组（对照组）：注射与PD组和Rg1组等体积的盐水.上述动物均于MPTP第5次注射后24h处死.于每次注射药物后观察小鼠是否出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等PD行为学表现,判断PD鼠模型是否成功. 1.2.2免疫组织化学检测小鼠麻醉后,行40g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定,迅速开颅取脑,40g/L多聚甲醛固定48h(4℃)后,石蜡包埋切片.实验时取脑组织切片常规脱蜡至水后,用TBST(pH7.4±0.2)洗涤；组织抗原行水浴法热修复；30mL/L过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常非免疫动物血清室温孵育10min；同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人COX2mAb(1∶100)、兔抗人PGE2mAb（1∶300）、兔抗人NFκB（p50）多克隆抗体（1∶100）、小鼠抗人THmAb(1∶400),4℃过夜；TBST洗涤后,加入生物素标记第二抗体室温孵育；TBST洗涤,加入链霉素抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育20min,DAB显色,中性树胶封固,光镜下观察照相.1.2.3arker为参照，依Mr大小切取条带,取相应条带分别加入COX2一抗(1∶400)，PGE2一抗（1∶600），NFκB（p50）一抗（1∶200）和TH一抗(1∶1000),4℃过夜,TBST冲洗后,分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠IgG抗血清(1∶200)室温震荡孵育2h,TBST洗涤后,与卵白素辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5h,DAB显色.将特异性蛋白条带扫描后,在同一条件下应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定条带平均灰度值.统计学处理:选定黑质所在区域,采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数.各组每只动物的3张脑片数值相加后取平均值,实验结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析.组间比较采用单因素方差分析和SNKq检验，两变量间关系分析采用简单线性相关分析法.P0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1行为学观察PD组小鼠于第1次注药后10~20min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾,MPTP第5次注射后,PD组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状；对照组未出现上述行为学变化；Rg1组与PD组相比较，上述行为学症状明显减轻.2.2免疫组化检测2.2.1黑质区TH阳性神经元数量变化对照组黑质致密部可见大量的TH阳性神经元,且排列整齐,呈条带状(图1A)；PD组（57.2±12.1）与对照组（169.7±24.6）相比较,TH阳性神经元的数目减少约60%(图1B),Rg1组（145.8±28.4）TH阳性神经元的缺失较PD组明显为轻,仅较对照组减少约32%(图1C).2.2.2黑质区COX2，PGE2和NFκB阳性细胞数量变化PD组与对照组相比较，黑质区可见大量COX2（28.2±5.1vs1.0±0.3），PGE2(36.1±4.2vs3.2±0.4)和NFκB（34.6±5.6vs2.5± 0.8）阳性细胞（图2A，C，E）；Rg1组黑质区COX2(1.9±0.7)；PGE2(4.6±0.3)和NFκB(4.9±2.1)阳性细胞较PD组有显著减少（图2B，D，F）.图像分析结果显示，PD组，Rg1组和对照组间差异均有统计学意义（P0.01）.同时COX2，PGE2间存在正相关关系（r=0.576，P0.05）；COX2和NFκB间也存在正相关关系(r=0.588,P0.05).2.3PTP复制的小鼠模型具有PD典型行为学表现；PTP可能激活NFκB,继而促进COX2和PGE2的表达,从而影响DA能神经元的变化，其结果与文献报道一致［8］.人参皂甙Rg1具有抗炎、抗氧化等作用.有报道称Rg1对MPTP致黑质区DA能神经元的损伤有一定保护作用［9］.为探讨人参皂甙Rg1对DA能神经元的保护途径,我们对小鼠给予人参皂甙Rg1干预，发现NFκB阳性细胞以及蛋白水平较PD组有明显减少，相应黑质区TH阳性细胞数量和蛋白水平较PD组降低程度减轻.可能的原因是Rg1通过减少NFκB表达来抑制COX2表达,减轻其介导的炎症反应,使黑质DA能神经元免于MPTP诱导的损伤，最终起到保护DA神经元作用［10］.综上所述，核因子NFκB可能是MPTP所致亚急性PD模型中脑黑质COX2表达及其介导的炎症反应的重要上游事件；人参皂甙Rg1可对核因子NFκB产生影响进而对黑质DA能神经元起一定的保护作用.【