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时间:2018-07-07
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1、详谈人脐血间充质干细胞培养方法的比较 0引言Introduction 关节软骨是一层低摩擦、高弹性、高渗透性的软骨组织,能够承受巨大的力学负荷,在关节活动中起重要作用,主要由透明软骨组成。关节软骨极其脆弱且自身修复能力低下,若未及时治疗,75%可进行性地发展成为骨性关节炎,严重影响生活质量。软骨缺损是骨科临床工作中面临的难题,如创伤、肿瘤等原因会造成软骨缺损,应用组织工程技术进行软骨缺损修复是近些年来的研究热点。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞,可用于细胞移植,治疗多种疾病。脐血间充质干细胞充足,作为骨
2、髓间充质干细胞的替代,具有采集方便,免疫原性低,发育阶段更原始、分化潜力更大等优点。本研究利用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离脐血单核细胞,并应用MesenGro人间充质干细胞培养基和DMEM培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞,比较其生物学特性的差异。 1材料和方法Materialsandmethods 设计: 细胞学对比观察实验。时间及地点:实验于2014年2至5月在深圳市第二人民医院中心实验室完成。 材料: 脐血标本:采集自深圳市第二人民医院产科,征得家属和孕妇的同意,签署捐献脐血的
3、同意书。产妇无急、慢性感染及血液系统疾患,新生儿为足月顺产,出生后无感染征象,采血量平均为50mL。 实验方法: 脐血的采集:新生儿娩出后,立即剪断脐带,按顺序用生理盐水、碘伏、乙醇消毒脐静脉,注射器抽取5mL肝素湿润管壁,针头刺入脐静脉并采集脐血50mL,注入采血瓶,肝素抗凝,浓度20U/mL,保存在4℃环境下,6h内对脐血进行处理。Ficoll密度梯度离心法分离脐血单核细胞:在50mL离心管中加入13mLFicoll-Paque单核细胞分离液,将肝素抗凝的脐血按3∶1的比例沿管壁缓慢滴入单核细胞分离液面之上
4、,注意保持清楚的界面;将离心管置入离心机中,2000r/min,4℃,离心20min。离心完成后,取出离心管,吸管插入界面层,吸取单核细胞,置入另一离心管中,生理盐水洗涤2次备用。 贴壁培养法分离纯化脐血间充质干细胞: 为了探讨、比较不同培养基对脐血间充质干细胞培养、扩增、纯化的效果,将Ficoll密度梯度离心法分离得到的脐血单核细胞随机分为两组,20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养,20份用DMEM培养基进行培养。具体步骤如下:将准备好的细胞以1.0106/cm2(T25培养瓶)的密度接种于M
5、esenGro人间充质干细胞培养基/DMEM培养基中,MesenGro组按1∶24的比例加入MSCprime原代间充质干细胞添加液,加入体积分数为10%的胎牛血清,按1∶100的比例加入青、链霉素,加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子,置入37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱内培养,24h后全量换液,弃掉未贴壁细胞,观察细胞生长情况,每3d换液1次,待细胞长到90%融合时,用0.25%胰酶-EDTA进行消化,显微镜下控制消化时间,按1∶2的比例接种于培养瓶中进行传代培养。 脐血间充质干细胞的形
6、态学观察: 通过倒置生物显微镜每日观察细胞的生长情况和形态特征,并进行记录和拍照,并用细胞计数板进行细胞计数。 脐血间充质干细胞的表面标志检测: 取生长良好的原代脐血间充质干细胞,去掉培养液,PBS洗涤2遍,加入0.25%胰酶-EDTA进行消化,置入离心管中,将离心管置入离心机中,1000r/min,4℃,离心5min,弃上清,PBS洗涤培养瓶,加入离心管中,再次将离心管置入离心机中,1000r/min,4℃,离心5min,重复前两步操作直至培养瓶内无间充质干细胞,将得到的细胞制成细胞悬液,加入Anti-CD
7、73/FITC、Anti-CD105/FITC、Anti-CD45/FITC、Anti-CD34/FITC,室温孵育30min,Navios流式细胞仪检测。 主要观察指标: 梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、原代细胞培养时间和数量。 统计学分析: 计量数据用x_±s表示,利用SPSS21.0软件进行分析。对两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量进行t检验,以P<0.05为差异有显著性意义。 2结果Results 2.1不同培养方法对脐血间
8、充质干细胞的影响 MesenGro组细胞接种于MesenGro人间充质干细胞培养基后,漂浮于培养液中,多为圆形或不规则形,接种平均24h后出现贴壁细胞,更换培养基后细胞继续生长。接种平均7d后,细胞胞体逐渐长大,出现零散的成纤维样的扁平梭形的间充质干细胞,单个核,剩下部分为破骨样细胞,胞体大,呈圆形,多个核,以间充质干细胞居多。接种平均10d后,细胞迅速增
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