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1、人肝癌干细胞侵袭及体内成瘤能力研究 近来研究证实肿瘤干细胞存在于白血病、神经胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤中,其在肿瘤的发生、发展、转移中起关键作用,是未来抗肿瘤治疗的重要靶点之一。目前,肝癌干细胞的生物学行为已成为肝癌研究的热点之一。本研究应用体外无血清悬浮培养法获得肝癌干细胞,以探讨肝癌干细胞的生物学行为。 材料与方法 一、材料 1.细胞系和实验动物：人肝癌细胞系MHCC97H为中山大学附属第三医院肝移植中心实验室保存样本。6～8周龄BABL/c裸鼠购自中山大学实验动物中心。实验过程中对裸鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的相关规定进行,符合动物伦理
2、学管理要求。 2.主要试剂和仪器：DMEM/F12培养基和DMEM培养基购自美国Gibco公司,B27购自美国Invitrogen公司,谷氨酰胺、肝素、胰岛素购自美国Sigma公司,人表皮生长因子和人碱性成纤维生长因子购自美国Peprotech公司,人白血病抑制因子购自美国Chemicon公司。荧光显微镜购自日本Nikon公司,聚合酶链反应(PCR)扩增仪、电泳槽和凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司。 二、方法 1.人肝癌细胞及干细胞的培养：无血清培养基为不含胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基，并添加谷氨酰胺(2mmol/L)、人表皮生长因子(20ng/ml)、人碱性成纤维
3、生长因子(20ng/ml)、2%B27(1:50)、人白血病抑制因子(10ng/ml)、肝素钠(1U/ml)、胰岛素(4U/L)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)。人肝癌MHCC97H细胞由含10%胎牛血清DMEM培养基常规培养。取对数生长期的人肝癌MHCC97H细胞，0.25%胰酶消化后吹打成单细胞悬液,以<104/ml密度接种至无血清培养基,加入培养瓶,竖直放入培养箱培养,每日摇晃数次。人肝癌MHCC97H干细胞形成微球,每2～3d半量换液1次,每6～8d为1代,获得稳定传代的人肝癌MHCC97H干细胞。 2.肝癌干细胞表面标志物的检测：包括分化群(CD)133、
4、CD90、上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)信使核糖核酸(mRNA)含量的检测,分别取对数生长期人肝癌MHCC97H干细胞微球和人肝癌MHCC97H细胞,胰酶消化离心后得到细胞沉淀。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次,取1106个细胞,常规提取RNA,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),β-肌动蛋白(β-actin)为内参照。CD133引物序列：上游5'-ACCGCTCTAGATACTGCTGT-3',下游5'-ATTCGGAGGACGTGTACGAT-3'。CD90引物序列：上游5&
5、#39;-AACCTGGGAGAGACTTGGAT-3',下游5'-AATGCTGGAGATGCTCAGTT-3'。EpCAM引物序列：上游5'-GTCAATGCCAGTGTACTTCA-3',下游5'-GTCCTTGTCTGTTCTTCTGA-3'。β-actin引物序列：上游5'-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3',下游5'-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。PCR反应条件：95℃5min,95℃15s,60℃15s,72℃32s,35个PCR循环。采用荧光定量PC
6、R方法检测mRNA含量。 3.克隆形成实验：分别取对数生长期人肝癌MHCC97H细胞和人肝癌MHCC97H干细胞微球,胰酶消化收集细胞,吹打成单细胞悬液,将细胞稀释成1103/ml,分别吸50、100、200μl接种于96孔板,各孔补加培养基至300μl。晃动培养板使细胞分布均匀。培养7d后,吸去各孔培养基,PBS漂洗2次,各孔加200μl结晶紫染色液,充分覆盖孔底,20min后将96孔板置于自来水下冲洗,冲洗后晾干,计算集落数。克隆形成率=集落数/细胞接种数100%。 4.肿瘤细胞侵袭实验(Transes;104个细胞,用含1%胎牛血清DMEM培养基培养。在下室内加入含
7、10%胎牛血清DMEM培养基。每组细胞重复3个样本,常规培养48h后取出上室,擦去微孔膜上层细胞后用HE染色,光学显微镜下观察微孔膜下层细胞并计数。观察5个视野,取其平均值作为穿膜细胞数。 5.裸鼠成瘤实验：分别取对数生长期人肝癌MHCC97H细胞和人肝癌MHCC97H干细胞微球,制备单细胞悬液计数,按2103、2104、2105个/只分别接种于BALB/c裸鼠背部左侧或右侧皮下,每组6只裸鼠,
