邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤sosp9607细胞作用及机理研究

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1、邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理研究【摘要】目的:研究邻氨基酚去甲表鬼臼毒素（ODE）抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用及机理.方法:采用MTT比色法测定体外抗骨肉瘤SOSP9607细胞作用，透射电子显微镜观察细胞凋亡形态学；采用激光共聚焦显微镜测定SOSP9607细胞内〔Ca2+〕,〔Mg2+〕,pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度；免疫细胞化学技术检测细胞内Bc12和Bax表达.结果:ODE时间、浓度依赖性地抑制SOSP9607细胞生长，诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细

2、胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等；剂量依赖性地增加SOSP9607细胞内Ca2+，Mg2+浓度而降低细胞内pH值和线粒体膜电位；使SOSP9607细胞内Bcl2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加.结论:邻氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP9607细胞生长，其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及Bcl2和Bax蛋白表达而诱导细胞凋亡有关.【关键词】邻氨基酚去甲表鬼臼毒素骨肉瘤肿瘤细胞凋亡线粒体膜电位bcl2蛋白Bax蛋白　　0引言　　骨肉瘤是起源于骨组织的最常见的恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，任

3、何年龄均可发病，而以15～25岁青少年居多.是原发性恶性骨肿瘤中最常见，恶性程度最高的骨肿瘤，有早期发生远处转移(易发生肺转移)的特点，预后不良.通常认为，骨肉瘤只要明确诊断，尚无肺转移，应施行高位截肢术或关节离断术，若合并单一肺转移源者可同时施行截肢术和肺转移源切除术.但是，骨肉瘤恶性程度高，截肢等破坏性手术后，生存机会从未超过20%，且骨肉瘤截肢术后80%以上患者均会出现肺转移〔1-3〕，基于这样的事实，目前骨肉瘤之治疗强调早期综合治疗.在早期综合治疗的措施中，由于骨肉瘤对放射治疗不敏感，仅用于手术前、后之辅助治疗，或肿

4、瘤不能切除或肺转移时应用.所以骨肉瘤早期综合治疗措施以手术和化疗为主.这就促使了众多的学者寻找有效的抗骨肉瘤药物，试图通过化疗以期改善骨肉瘤患者的预后.　　鬼臼是一传统的抗肿瘤中草药，其衍生物VP16，VM26已成功用于临床，对多种肿瘤显示出良好的效果〔4-5〕，被认为是最有效、最有希望的抗骨肉瘤药物.但由于其溶解度差，生产工艺复杂，毒性高等原因限制了其广泛应用.新近发现鬼臼毒类衍生物有很强的抗氧化、清除自由基作用，此作用与其抗肿瘤作用相关〔6-7〕.因此，鬼臼成为最有希望研发高效低毒抗骨肉瘤新药的领域.据此我们将研究新鬼臼

5、毒类衍生物邻氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤作用，并初步探讨其机理.　　1材料和方法　　1.1材料邻氨基酚去甲表鬼臼毒素由兰州大学化工学院田瑄教授惠赠，用50g/LDMSO溶解；RPMI1640为GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物有限公司产品，室温溶化后置56℃水浴灭活30min，无菌分装密封后置-20℃冰箱冷冻保存备用；胰蛋白酶（Trypsin,Try）∶Difco1∶250，上海化学试剂站分装厂产品，用无Ca2+，Mg2+的DHanks配成2.5g/L溶液；四甲基偶氮唑盐〔3(4,5dimethylt

6、hiazol2yl)2,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT〕为Sigma公司产品，用0.01mol/LPBS（pH为7.2）配成5g/L（临时现配）；十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate,SDS)为Sigma公司产品，用0.01mol/L盐酸配成100g/L的酸化SDS溶液，室温保存备用；Fluo3/AM,MagFluo4/AM,CarboxySNARF1/AMandMitoTrackerGreenFM探针为MolecularProbesCo.(Eugene,

7、Oregon,USA)产品.鼠抗人Bcl2单克隆抗体（Clone：Bcl2），鼠抗人Bax单克隆抗体（Clone：2D2）为Zymedlabortrory产品，均1∶100稀释.HistostainPlusKit(抗小鼠免疫组化试剂盒，LHK611)为晶美公司产品.　　1.2方法　　1.2.1细胞株及培养成骨肉瘤SOSP9607细胞株由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室引进.细胞株用含体积分数为100mL/L的小牛血清、2mmol/LL谷氨酰胺（LGln）,1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素的R

8、PMI1640完全培养液，在37℃，50mL/LCO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养.传代时先用2.5g/L胰蛋白酶（Try）消化2~4min，倾弃Try，再用培养液将细胞吹打制成单细胞悬液传代，每2~3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验.　　1.2.2邻氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP