三维试验检测阴沟肠杆菌产β内酰胺酶

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1、三维试验检测阴沟肠杆菌产β内酰胺酶作者：张益新单位：浙江省义乌市中心医院义乌【关键词】阴沟肠杆菌超广谱β内酰酶AmpC酶三维试验本研究通过对阴沟肠杆菌产β内酰胺酶(主要是ESBLs与AmpC酶)的监测，了解临床上耐三代头孢的阴沟肠杆菌耐药的主要原因及ESBLs与AmpC酶于此类耐药中出现频率（即其流行情况），并同时统计这些耐药菌对其它抗生素的耐药情况，现报道如下。1材料与方法1.1材料①菌株：2006年1月～2007年2月本院收集的对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌33例。大肠埃希菌标准菌株ATCC25922

2、一株。质控株为经VITEK确认产ESBLs的肺炎克雷伯菌一株。②药敏纸片：头孢西丁（FOX）、头孢吡肟（FEP）。③其它：生理盐水、克拉维酸粉剂、氯唑西林粉剂、血平板、MH平板等。1.2方法①粗提酶（冻融裂解法）[1]：新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于1/4MH琼脂平板（φ=90mm）上，35℃培养24小时后用无菌棉签取下全部菌苔于1ml灭菌生理盐水中（用1.5ml离心管），-80℃冻融数次，培养无菌生长后4℃10000r/min离心20min，取上清液头孢硝噻吩纸片确定β内酰胺酶存在[1]

3、后置-20℃保存待用。②改良三维实验[1，2]：将大肠埃希菌标准株ATCC25922配成0.5McFarland密涂于两块MH琼脂（=90mm）10min后于平板中央分别贴30μgFOX纸片和30μgFEP纸片各1片，距纸片5mm处沿两边分别垂直打两个1mm×10mm的槽，FOX纸片平板的两槽内分别加酶粗提液+10μg/ml氯唑西林(9∶1)25～40μl和酶粗提液25～40μl。而FEP纸片平板上的两槽内分别加酶粗提液25～40μl和酶粗提液+10μg/ml克拉维酸(9

4、∶1)25～40μl。35℃培养24小时后判断结果。③结果判断：抑菌圈均完整光滑表示为阴性结果，即两种酶均不产；ESBLs阳性：加酶粗提液的槽与FEP纸片交界处出现扩大生长，而它处抑菌圈完整光滑；AmpC酶阳性：加酶粗提液的槽与FOX纸片交界处出现扩大生长区，而它处抑菌圈完整光滑；ESBLs+AmpC酶：加酶粗提液的槽与FEP纸片和FOX纸片交界处均有扩大生长区，而其它处抑菌圈光滑完整；纸片与两槽交界处均出现扩大生长区表示抑制酶的抗生素量不足或产ESBLs与AmpC酶之外的酶。2结果2.1三维试验结果33株阴沟肠杆菌没有

5、单产AmpC酶，表现为单产ESBLs24株，占72.7%；表现为同时产两种酶8株，占24.2%；结果阴性即不产这两种酶1株（头孢硝噻吩纸片确定β内酰胺酶试验阳性）。2.2药敏结果统计本院所检出阴沟肠杆菌254株，其中对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌有171株，占67.3%。171株体外实验对亚胺培南敏感率为97.7%，头孢替坦敏感率为27.5%，复方新诺明为22.8%，对氨基糖苷类、喹诺酮类等抗生素均高度耐药，对氨苄西林与头孢唑啉全部耐药。本实验对三代头孢耐药的33株阴沟肠杆菌药敏情况，基本与总的统计结果符合。这些阴沟肠

6、杆菌体外实验对亚胺培南敏感率为100%，而其他抗生素均呈现高度耐药甚至全部耐药。3讨论ESBLs是一种丝氨酸蛋白酶，Bush分类属Group2，而Ambler分类属ClassA，主要由质粒介导，少数由染色体介导，往往具有多重耐药性，常见于肺克、大肠、阴沟等菌中。能灭活三代头孢菌素等β内酰类抗生素和氨曲南，不能水解头霉素类，能被克拉维酸等酶抑制剂抑制，但不能被氯唑西林所抑制。VITEK对产ESBLs细菌检出率敏感性为99.5%，特异性为100%[3]。本试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产ESBLs32株，占96.97

7、%。AmpC酶Bush分类属Group1，而Ambler分类属ClassC，主要由染色体介导少数由质粒介导，常见于阴沟、产气肠杆菌等菌。AmpC酶能被β内酰类抗生素诱导，属诱导酶，它不能被克拉维酸等酶抑制剂抑制，但能被氯唑西林所抑制。本试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产AmpC酶8株，占24.24%。三维试验由ThomasonSander创立，是公认的AmpC酶检测方法，虽操作繁琐费时但准确度高，结果清晰易判读，是检测ESBLs和AmpC酶的经典方法。试验结果显示，我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs，这

8、与文献[4]阴沟肠杆菌以产AmpC酶为主不符，可能存在地区差异。我院所检出阴沟肠杆菌对三代头孢耐药达67.3%，较文献[5]报道的40%～60%稍高。ESBLs主要由质粒介导，很容易在细菌间传递扩散，导致对抗生素耐药细菌的广泛传播，及治疗选药的困难。有资料显示，治疗产两种&b