第五章 sem样品制备技术new

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1、第五章SEM样品制备技术第一节SEM样品制备技术概述一、生物样品按含水量分类1.含水量少的硬组织包括：毛发、牙齿、植物花粉、子粒等，昆虫的口器、刚毛、鳞毛、卵壳等处理过程：清洁表面→粘胶→喷金→观察2.含水量多的软组织包括：动植物器官、组织及细菌、真菌等处理过程：取材固定→脱水→干燥→喷金→观察1.使样品的表面形貌结构保持活体时的近似形态,所观察的表面要求处理干净。2.对拟研究内表面结构，可采用冷冻断裂技术获取一个新的观察面。3.尽可能在样品没变形的情况下除去水份，即对样品进行“无损干燥”。4.样品表面应有良好的导电

2、性能和二次电子发射率。5.进行细胞化学研究时，要求标记物有一定的形态，以便于识别。二样品制备的基本要求三样品制备的一般流程第二节样品制备的一般程序一样品的前处理二样品的干燥四样品表面的导电处理三样品装台（粘胶）（一）、样品的前处理一般过程取材→清洗→固定→脱水（二）、SEM与TEM在前处理中的区别1.样品大，一般6～100mm2,高厚5－10mm,对于易卷曲的样品可固定在硬纸板或卡片纸上。2.特别注意表面清洁（生理盐水、缓冲液、5%苏打水、超声波震荡、酶消化）3.固定时间适当延长，除了戊二醛、锇酸、高锰酸钾外做固定液

3、外，还有Paleace，Dalton固定液4.脱完水时要用进入中间液进行置换。一样品的前处理（三）思考题在TEM与SEM样品制备过程中，SEM制样在脱水后需要进行特殊干燥处理，而TEM超薄切片中脱水后无需干燥处理，分析其中原因。从两方面考虑：1.样品块的大小不同。2.SEM与TEM成像机理及观察样品的特征区域不同。二样品的干燥（一）、空气干燥法（自然干燥法）1.基本描述将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥，也可直接(不脱水)放在干燥器中干燥。2.基本特点优点：简便易行、节省时间缺点：由于脱水剂挥发时

4、表面张力的作用，组织块会而产生收缩变形方法1：单固定或双固定→脱水→样品置于100％的脱水剂中→在空气中自然干燥；方法2：固定→（组织导电处理）→浸泡在缓冲液与乙醚的1：1中5min→空气干燥；方法3：单固定或双固定→乙醇脱水→浸没于六甲基二硅胺烷HMDS中二次每次15min→通风厨干燥1h3.常用方法（二）、临界点干燥法(CPD:criticalpointdryer)1.基本含义：临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。2.基本特点优

5、点：避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。操作较方便，快速2～3小时即可完成，常用缺点：需要特殊仪器设备---临界点干燥仪。3.基本概念临界点：物质的气态和液态两相之间达到相同密度、成为均一流体时的温度和压力的总称。此时的温度称为临界点温度，压力称为临界点压力。中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。4.常用干燥剂干燥剂丙酮、醋酸戊酯5.常用中间剂：中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。试剂：醋酸（异）戊酯、丙酮6.干燥过程：固定脱水→转入中间液→移至样品室→用液体CO2置换醋酸异戊

6、酯→CO2汽化排气→干燥7.CO2临界点干燥器工作原理(1)脱水不彻底(2)醋酸异戊酯反流(3)样表粘有过多醋酸异戊酯(4)样品量过多(5)样品室温度高，注入CO2困难注入CO2量太少(6)样品室漏气8.临界点干燥失败（不彻底）的原因样品块过大。组织块几何空间中心位置的水份无法经脱水、中间剂置换、CO2置换等过程除去，CO2也无法完全置换掉中间剂，造成样品内外部由液CO2（占95％－97％）、中间剂醋酸异戊酯2－3％样品中心位置游离态水份1－2％组成，在充分达到CO2临界态的40－45℃，压力10－11MPa时，样品

7、几何中心位置游离态水由液体气化为水蒸汽时(液态醋酸异戊酯由液体气化为蒸汽时）有表面张力的存在，从而使样品有少量变形(2)CO2放入或排出时,样表压力骤增减(3)生物样品本身性质决定及临界点干燥本身的缺陷造成样品有少量变形9.原因分析：经CO2临界点干燥之后的样品仍有少量变形的原因？10.干冰优点(1)有利于微小样品的干燥(2)无需钢瓶，搬运方便(3)能准确放入足够的CO2量(4)夏天使用方便(5)不污染样品玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，CPD(criticalpointdryer)干燥玫瑰花瓣表面的SEM照片

8、(850X)，风干凝固（三）、冰冻干燥1.含水样品直接冷冻干燥⑴常规步骤：取材→固定→冷冻保护处理→快速冷冻→升华（10-2乇）干燥→装台镀膜⑵基本特点：无需脱水，不会使样品收缩，较早使用的方法。但花费时间长，消耗液氮多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用.基本描述：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程.⑴基本描述：样