DBS13001-2015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测.pdf

《DBS13001-2015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、DBS13河北省地方标准DBS13/001—2015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测2015-04-23发布2015-05-01实施河北省卫生和计划生育委员会发布DBS13/001—2015前言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。IDBS13/001—2015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测1范围本标准规定了贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类

2、、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中ＧⅠ型和ＧⅡ型诺如病毒的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。诺如病毒norovirus诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链RNA，组成长约7kb～7.5kb，电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为ＧⅠ～ＧⅤ５个基因型，其中感染人的主要是ＧⅠ型和ＧⅡ型。3设备和材料3.

3、1电子天平：感量0.1g。3.2组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。3.3普通冰箱：2℃～8℃。3.4超低温冰箱：-80℃±5℃。3.5高速冷冻离心机：最大离心力大于15000g。3.6恒温水浴箱或金属浴：37℃～65℃。3.7PCR扩增仪。3.8实时荧光PCR扩增仪。3.9电泳仪。3.10凝胶成像系统。3.11震荡混匀器。3.12电热干燥箱。1DBS13/001—20153.13pH计。3.14水过滤系统。3.15微量可调移液器：1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。3.16洗耳球或电动移液器。3.17无R

4、NA酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌50mL离心管、无菌1.5mL离心管和PCR管。3.18无RNA酶的一次性移液管：10mL、25mL。3.19混合硝酸纤维素膜：孔径0.22μm。4试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。4.1无RNA酶的超纯水：见附录A.1。4.2甘氨酸缓冲液：见附录A.2。4.35XPEG8000溶液：见附录A.3。4.42.5mol/L氯化镁(MgCl2)溶液：见附录A.4。4.5牛肉膏-甘氨酸洗脱液:见附录A.5。4.6氯仿。4.71mol/L盐酸溶液。4.81mol/L氢氧化钠溶液。4.9病毒RNA

5、提取试剂盒。4.10TaqDNA聚合酶：-20℃保存，避免反复冻融。4.11逆转录酶：-20℃保存，避免反复冻融。4.12RNA酶抑制剂：-20℃保存，避免反复冻融。4.13dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。4.14引物和探针：使用浓度为25μmol/L，-20℃保存，引物和探针序列见表1和表2。表1普通RT-PCR检测引物检测的病毒类群引物序列片段大小/bp正向引物F:5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’GI和GII326反向引物R:5’-TCATCATCACCATAGAAAGA

6、G-3’2DBS13/001—2015表2实时荧光RT-PCR检测引物和探针检测的病毒类群引物和探针序列片段大小/bp正向引物F:5'-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’GI反向引物R:5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’86探针:5’-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-3’正向引物F:5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’GII反向引物R:5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’89探针:5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGAT

7、CG-TAMRA-3’4.151×TAE：见附录A.6。4.16分子量标记：100bp～1000bp。4.17诺如病毒阳性对照。4.18诺如病毒阴性对照。4.19溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）：见附录A.7。4.2010×上样缓冲液：见附录A.8。4.21含0.5μg/mL溴化乙锭（或5%GoldView）的1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.9。5检测程序诺如病毒检测程序见图１。3DBS13/001—2015图1诺如病毒检测程序6检测步骤6.1样品的运输与保存运输过程中保持样品温度在0℃～5℃。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂

8、时不能检测应将样品保存于-80℃冰箱中,避免样品反复冻融。6.2样品处理和病毒富集6.2.1贝类6.2.1.1取样：首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用无菌的剪刀和镊子