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1、GB4789.2—201xxxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布中华人民共和国卫生部发布2010-06-01实施2010-××-××发布食品安全国家标准食品微生物学检验食品中诺如病毒检测(征求意见稿)1GB4789.2—201x前言本标准代替SN/T1635—2005《食品中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》。本标准与以上标准相比,主要变化如下:——标准名称修改为“食品微生物学检验食品中诺如病毒检测”;——增加了检验程序;——修改了病毒富集步骤;——删除了普通RT-PCR检验方法。107GB4789.2—201x食品安全国家标准食品微生物学检验食
2、品中诺如病毒检测1范围本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。2术语和定义2.1实时荧光RT-PCRreal-timefluorescence在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接受到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2.2C值cyclet
3、hreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1无菌平皿,直径90mm;3.2无菌手术剪;3.3无菌镊子;3.4无菌50ml离心管,耐氯仿,可高速离心;3.5无菌85ml离心管,耐氯仿,可高速离心;3.6无菌胶头滴管;3.7无菌移液管,10ml;3.8移液枪,1-1000ul;3.9匀浆机;3.10超净工作台;3.11天平,精密度为0.01g;3.12高速冷冻离心机,10000g;3.13恒温摇床;3.14荧光定量PCR仪。4试剂4.1含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液,配制方法见A.
4、1;4.2PEG8000,配制方法见A.2;107GB4789.2—201x4.3病毒RNA提取试剂盒;4.4Nuclisens裂解液;4.5逆转录试剂盒;4.6荧光PCR定量试剂盒;4.7缓冲液1×TAE,配制方法见A.3;4.8溴化乙锭(EB)溶液10ug/uL,配制方法见A.4;4.9琼脂糖凝胶,配制方法见A.5。5检验程序无菌操作,取食品5g,加入25ml缓冲溶液匀浆37℃孵育30min或室温震荡30min,离心取上清,加10ml氯仿,震荡,离心取上清,加入等体积PEG8000,混匀冰上放置1h,离心,弃上清,用2mlNuclisens裂解液溶解沉淀使用QIAGEN试剂盒提取病毒
5、RNA使用诺沃克病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针),定量检测诺沃克病毒6操作步骤6.1诺如病毒的富集6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样,取食品5g,加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液,匀浆3min,为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒,分两次匀浆,中间停顿1min。107GB4789.2—201x6.1.2将均质液转移到50ml离心管中,恒温摇床37℃孵育30min或室温震荡30min,4℃,10000g离心30min。6.1.3取上清,转移到另外的离心管中,加入10ml氯仿,充分震荡,放置10min,中间震荡一次,4℃,10000g离心30min。6.1.4取上清液
6、25ml转移到85ml离心管中,加入等体积的PEG8000溶液(PEG的终浓度为8%),充分震荡混匀。6.1.5在冰上放置至少1h,4℃,10000g离心5min,弃上清,加入2mlNuclisens裂解液溶解沉淀,如不马上进行检测,将沉淀用1ml无菌水重悬,-70℃保存,避免反复冻融。6.2诺如病毒RNA提取使用商品化的病毒RNA提取试剂盒提取和纯化,步骤参考说明书,提取完成后,为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂,操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。6.3实时荧光RT-PCR以诺如病毒RNA作为阳性阳性对照,以不含诺如病毒的样品RNA作为阴性对照,以水代替模
7、板作为空白对照,每个体系设置两个平行反应.可根据具体情况调整总体积。6.3.1实时荧光RT-PCR反应体系实时荧光RT-PCR反应体系见表1表1实时荧光RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/uLGⅠGⅡRT-PCR缓冲溶液10×1×55MgSO25mmol/L1mmol/L22dNTPs10mmol/L0.2mmol/L11上游引物20umol/L1umol/L2.52.5下游引物20umol/L1umol/L2.52.5
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