对研发新型结核病疫苗的分析和展望

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对研发新型结核病疫苗的分析和展望2010级医学检验专业1班FFM摘要结核病是公共卫生当前面临的重要问题。由于BCG预防效果不佳，研究和开发新型结核病疫苗显得必须且急迫。简要对当前结核病疫苗的研发取得的成果进行简要的分析及仍需解决的问题，以期对科学研究者进一步努力提供参考。关键词结核控制；卡介苗(BCG)；新型疫苗前言结核病是一种棘手的重大传染病。虽然存在一些有一定疗效的治疗药物,亦有预防性疫苗———卡介苗(BCG);但结核病仍在世界范围流行,且发病率和病死率居高不下。近年来，伴随多重耐药结核杆菌(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)的出现，TB与艾滋病联合发病，以及近年来对结核防治重视不够，TB呈现出明显上升趋势。2013年世界卫生组织发表的全球结核病状况可见，全球1/3的人都感染结核，其中64%所有结核病例中有91%是MDR-TB，结核还是导致HIV感染者头号杀手之一【1】。目前全世界的TB防治方案都是卡介苗(bacillecalmette-guerin，BCG)接种和利福平、链霉素等化学药物治疗。BCG能保护幼儿，但对成人无效，并且BCG的保护作用随年龄增长而减弱【2】，而且对于免疫缺陷患者及孕妇都不能接种BCG【3】，这是其使用受到了一定的限制。虽然化学药物能够达到一定的治疗效果，但由于治疗周期长以及MDR-TB的大量出现，已经远远不能满足人们对于该病治疗的诉求。因此，研发更为安全、高效的新型TB疫苗成为当务之急，将是实现2050年WHO预期消灭TB的重要手段。1.结核疫苗取得的进展及分析在过去的十几年，结核疫苗的研发取得较大进展，截至目前已经有12个品种进入临床实验阶段【4】。当前新型结核病疫苗疫苗包括重组BCG、亚单位疫苗、DNA疫苗。【5】1.1重组BCG重组BCG(recombinantBCG,rBCG)是将一些重要抗原尤其是MTB表面蛋白相关毒力因子导人BCG菌株，从而得到一个重组BCG疫苗，以期能取代传统BCG疫苗，如rBCGΔureC：Hly(VPM1002)和rBCG30目前已经进入临床前期。临床研究表明，该候选疫苗可以产生比亲本BCG更强的抗结核保护力和安全性。以及EB病毒融合基因重组BCG穿梭质粒的构建及表达成功也为疫苗研制做出了极大贡献【6】；微小隐孢子虫重组BCG疫苗保护作用观察其结果也能产生良好的免疫保护作用【7】。虽然重组卡介苗可诱导全面的体液免疫和细胞免疫反应，但其为活疫苗，存在着返祖的风险，这一点也是不可避免的。1.2亚单位疫苗目前MTB亚单位疫苗主要有两种类型，一种是由2～3个MTB主要毒力相关蛋白构成；另一种是表达一个或是多个MTB蛋白的活载体疫苗。目前有研究者对Ag85B表位多肽进行研究，旨在找出免疫效果最好的一个片段，作为优势肽表位疫苗，表位疫苗具有可灵活组合的优点，再加上佐剂的应用，研制出效果最佳的组合疫苗。因Ag85B作为全长抗原，不但含有Th细胞、CTL细胞、B细胞、NK细胞等识别的免疫相关表位，还含有对保护性免疫不利的结构，例如抑制性或毒性表位、病理性及自身抗原交叉反应性表位等；而且表位存在优势与否之分，关系到对抗原性的贡献。Ag85B还包含隐匿的保护性表位，造成保护性免疫反应不够强大，且可发生免疫偏移，造成T、B细胞间或者T细胞亚群间互相残杀而加重感染【8】。而表位抗原可避免上述缺陷，首先能去除对保护性免疫不利结构，规避免疫抑制或免疫逃避；其次定位精确，可以选择优势表位，结合隐匿的保护性表位，进一步增强表位功能的表达；再次可进行不同表位间的排列组合，制成多表位抗原，增强保护性免疫反应。关于研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护能力， 特异性抗体的产生表明免疫获得成功ESAT6-CFP10融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分。但与BCG相比保护力仍有一定差距，而导致其保护作用不够理想。【9】显然目前对于亚单位疫苗候选基因筛选工作只做了很小的一部分，大量工作等待我们去开展。病毒载体结核疫苗也有3个型别已进入临床试验阶段：痘苗病毒Ankara(MVA)、复制缺陷腺病毒5(Ad5)、复制缺陷腺病毒35(Ad35)。研究表明，表达早期分泌性抗原靶6000(earlysecretaryantigenictarget，ESAT)的减毒鼠伤寒杆菌株可增加肺部MTB清除率，但由于上述亚单位疫苗的载体基因组庞大且并发症多等原因，限制了其进一步应用。腺病毒载体的遗传背景较为清楚，病毒颗粒比较稳定，安全性好【10】。腺病毒不仅能高效、瞬时表达，而且由于其自身基因组较小，不整合进宿主细胞基因组，是以附加体形式游离在宿主细胞基因组外，这就避免了病毒载体插入宿主细胞基因组可能引起基因突变等不良后果。复制缺陷型腺病毒不但具有腺病毒的上述特点，而且具有更高的安全性。但是，如频繁感染腺病毒(Ad)，机体将会产生相应抗体，其中Ad5比Ad35更为显著，更值得注意的是，目前有超过20%的非洲人先天就存在Ad35的特异性抗体，这些预先存在的抗体必然会影响基于Ad载体疫苗的效果。这也是腺病毒载体应用的弊端。【11】但总体而言，同DNA疫苗和多肽疫苗相比，重组活的结核病亚单位疫苗能在体内持续表达MTB特异性抗原，使其具有高效和经济的优势。1.3DNA疫苗DNA疫苗是向宿主体内注射DNA载体使宿主通过自身包装表达机制来表达DNA载体中融合蛋白，从而避免了使用佐剂的副作用，结核DNA疫苗研究领域中约6种结核病DNA疫苗在动物实验中获得较理想的效果【12】。有研究进行了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建且成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6，该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。经ELISPOT检测显示pVAX1/ESAT-6免疫组小鼠产生IFN-γ的细胞数显著高于对照组，表明结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6能在小鼠体内有效诱导记忆性T细胞产生IFN-γ的ESAT-6特异性细胞免疫应答。【13】在DNA疫苗的研发中，在疫苗候选分子选定的前提下，选择合适的表达载体，采用合适的免疫方法使疫苗候选分子能在被免疫者体内有效表达、诱发适合的免疫效应是促使疫苗发挥作用的关键。DNA疫苗既有类似减毒活疫苗可持续诱导体液免疫和细胞免疫的优点，又有灭活疫苗或亚单位疫苗不存在疫苗返祖、毒力增强危险的安全性而备受关注。虽然目前所有动物模型研究均已证明DNA疫苗安全有效,但没有足够的依据能排除理论上可能的危险性,如可能整合入宿主细胞基因组，可能引起免疫系统功能紊乱等。1.4佐剂新型佐剂辅助的蛋白疫苗的研究也是结核疫苗研究方向之一，佐剂除了可以增强疫苗免疫原性，促进免疫细胞分化成熟，还在诱导免疫应答倾向(Th1或Th2)，甚至改变特异性T细胞克隆群等过程中都发挥了重要作用，这对于抗结核感染显得意义重大。目前研究领域的热点之一是基因佐剂（genetic adjuvant）就是将某些细胞因子或免疫相关基因克隆到真核表达载体上，将纯化的重组真核表达质粒以不同途径导入动物体内，通过重组质粒在接种动物机体内的吸收分布和目的基因的表达及分泌，以直接或间接方式增强T、B细胞的免疫应答反应和疫苗的抗体水平。基因佐剂作为一种新型的免疫佐剂具有广泛的发展空间，目前，基因佐剂常与核酸疫苗共用以提高免疫效果。细胞因子是基因佐剂常选择的有效靶基因，越来越多的研究表明，以细胞因子为靶基因的基因佐剂具有免疫佐剂效应。而且，以细胞因子基因为靶基因的基因佐剂较比传统的蛋白型细胞因子佐剂具有诸多优势，如成本低,体内存活时间较长。蛋白型的细胞因子免疫佐剂却常存在一些缺点和不足,体内半衰期较短,活性易受体内各种水解酶、血浆蛋白和pH值等内环境的影响【14】。此外还有选择免疫相关基因及miRNAs,其中已有研究已确凿表明开发以miRNAs为靶基因的基因佐剂研究已经初步一些miRNAs在免疫调控中起着举足轻重的作用显现出了巨大的应用潜力和价值，同时这也为深入理解miRNAs在免疫系统中的调节功能，发现免疫应答调节的新靶点，以及免疫相关疾病的治疗提供了新思路。2.有待解决的问题人们对结核病发生机制的认识仍然不足,限制了对结核病治疗药物和新型疫苗的研发。目前可行的疫苗免疫策略主要是使用BCG或其他疫苗初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫。然而,疫苗的免疫策略、免疫剂量、免疫途径、强化免疫次数和免疫时机都有待研究【15】。反映疫苗保护力的免疫指标不明确、很难确定哪类疫苗进入临床试验、缺乏临床试验场地、疫苗效果评价需要很长时间及耗资巨大,增加了结核疫苗研究的难度和风险。3.结核疫苗研发展望在对人和动物进行实验时，检测到结核分枝杆菌适应性免疫应答的特点之一为感染早期T细胞免疫应答延迟，而且T细胞的应答维持对抗感染极其重要【16】。只有充分了解结核杆菌致病机制才能研制出对不同人群有效的结核疫苗，并确认其保护性。疫苗研发的成功将更依赖于我们对新方法的使用，结核病疫苗应利用系统生物学知识。而要实现此目标，需要研究人员的加大努力以及加速大规模临床前和临床试验，而革新性的临床和法规方法会进一步促进这些试验。在这个过程中，评价技术、评价指标、评价标准则非常重要，特异性细胞免疫学检测对研究和将来的产品质控肯定必不可少，动物学评价也占有重要地位。参考文献：1.WorldHealthOrganization.WHOREPORT2013GlobalTuberculosisControl-Surveillance,Planning,Financing[N].WorldHealthOrganizationGeneva,2013.2.SHE,HusseyG,LambertPH.Newvaccinesfortuberculosis[J].Lancet,2010.375:2110-193.NationalCenterforHIV/AIDS,ViralHepatitis,STD,andTBPreventionElimination,No.11,2011,4.刘彩念,余正.新型结核疫苗研究现状技术创新[J].TechnologyandInnovation，2011.5:70-73.5.刘珊珊，韩文瑜，雷连成，冯新，孙长江.结核疫苗研究进展[J].中国兽药杂志,2013,47(3):52-576.薛庆节，陈廷.EB病毒融合基因重组BCG穿梭质粒的构建及表达[J].微生物学免疫学进展,2010,38(2):24-27.7.魏庆宽，贾凤菊.微小隐孢子虫重组BCG疫苗免疫保护作用观察[J].中国人兽共患病学报,2010，26(5):436-441.8.申丹,肖婧,孙琳,Ag85B表位多肽对体外单核细胞增殖影响的研究[J].标记免疫分析与临床,2012,19(2):97-102.9.张海，师长宏.结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白诱导的小鼠免疫应答及其保护力[J].细胞与分子免疫学杂志2006,22(4):443-446.10.冯俊涛,李晓照,胡成.结核分枝杆菌分泌蛋白64基因重组腺病毒疫苗的构建[J].中华结核呼吸杂志,2010,4(33)307-309.11吴昊,王浩,于继云结核疫苗研究进展解放军医学杂志　2012,37(10):1003-100712梁艳,吴雪琼.结核病DNA疫苗研究进展[J].中国现代医学杂志,2011,21(13):1489-1500.13王雪梅,王英,薛玉芹,结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价.JSouthMedUniv,2013,33(7):945-950.14满朝来,常杨.基因佐剂的研究进展[J].中国生物工程杂志，2013，33(7):112-117.15达泽蛟，祝秉东，张颖.结核病免疫机制及疫苗研究进展[J].微生物与感染,2011,6(3):169-178.16.白旭华，霍万学.结核杆菌感染T细胞介导免疫应答研究的新进展[J].微生物学杂志， 2012,32(1):75-79