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时间:2018-05-08
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1、采用ISSR分子标记法鉴别道地药材化橘红的论文【摘要】目的探索用issr分子标记方法在核酸分子水平上鉴别道地药材化橘红。方法从20条issr引物中筛选合适的引物对化橘红、橘子、柚子等共16个样品进行pcr扩增及电泳分析,寻找特征位点。结果有2条issr引物扩增出较为明显的多态性特征条带,可单独或联合应用鉴别化橘红。结论issr作为一种简便、可靠的分子标记方法,可用于化橘红的鉴别。【关键词】化橘红;issr;分子标记技术 abstract:objectivetoidentifyexocarpiumcitrigrandisbyinter-simplesequencerepeat
2、markers.methodsprimerssuitableforroutineanalysis20intersimplesequencerepeatprimers,then,theyplesofexocarpiumcitrigrandis,citrusreticulataandcitrusgrandis(linn.)osbeck.resultstersamplifiedpolymophicbandsandsuitablefortheidentificationofexocarpiumcitrigrandis.conclusionintersimplesequencere
3、peatmarkersprovideaquick,reliablemolecularmarkerforidentificationofexocarpiumcitrigrandis. keycitrigrandis;intersimplesequencerepeat;identification 化橘红(exocarpiumcitrigrandis)是芸香科植物柚citrusgrandis(l.)osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮,通称柚皮橘红、化州橘红、柚子皮。.柚的栽培变种化州柚citrusgrandis“tomentosa”的外层果皮同作化橘红入药。药材呈对
4、折的七角或展开的五角星状,单片呈柳叶形,气芳香,味苦、微辛,具有散寒,燥湿,利气,消痰等功效。主产于广东、广西、四川、湖南、湖北、浙江,其中以广东化州产最为道地。 利用issr(intersimplesequencerepeat,简单序列重复区间)分析是基于pcr的分子标记技术,最早由zietkiecitrigrandis。作为易混用品进行比较分析,另采集新鲜橘子皮2批(高州产,编号j1、j2,经广东省药检所中药室莫结丽副主任药师鉴定为芸香科柑桔属citrusreticulata)、柚子皮4批[梅州产编号y1,广西产编号y2、y3,海南产编号y4,经广东省药检所莫结丽副主
5、任药师鉴定为芸香科植物citrusgrandis(linn.)osbeck],共计16批样本。 1.2试剂 tris、β巯基乙醇购自sigma公司;pcrbuffer、mg2+、taqdna聚合酶、dntps购自广州威佳生物技术有限公司及宝生物有限公司;超纯水、dgl2000dnamarke购自北京鼎国生物公司;琼脂糖购自广州宝泰克生物科技有限公司;issr引物由上海生工生物技术服务公司合成。其余试剂均为国产分析纯试剂。 1.2.1总dna提取液 三水合乙酸钠6.8g,十二烷基磺酸钠7g,聚乙烯基吡咯烷酮10g,乙二胺四乙酸二钠9.3g,氯化钠14.6g,加水定
6、容至500ml,用naoh(1mol/l)调ph至5.5,灭菌备用。 1.2.2kac溶液(2.5mol/l,ph4.8) 取醋酸钾122.7g,加水定容至500ml,用冰醋酸调ph至4.8,灭菌备用。 1.2.31×te缓冲液 取tris(1mol/l)1ml,edta(0.5mol/l)0.2ml,加水定容至100ml。 1.3仪器 eppendorfminispin离心机(德国eppendorf公司);9700型pcr仪(美国abi公司);pol离心管中,立即加入预冷至-20℃的丙酮1ml,振摇约5min,9000r/min离心6min;弃上清液,加入预
7、热至65℃的总dna提取液1ml,置65℃水浴中1h,期间不时振摇,取出,9000r/min离心5min;取上清液,加0.5ml苯酚异戊醇(体积比24∶1),混匀,至冰浴中放置10min,期间不时振摇,取出,15000r/min离心6min;取上清液,加入2/3体积的kac溶液(2.5mol/l,ph4.8),混匀,冰浴20min,15000r/min离心10min;取上清液,加入2/3体积的kac溶液(2.5mol/l,ph4.8)同上操作,重复1次;取上清液,加入2/3体积的预冷至-20℃异丙醇,
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