正文描述:《神经干细胞、丙戊酸联合应用对成鼠脊髓损伤的修复作用》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、神经干细胞、丙戊酸联合应用对成鼠脊髓损伤的修复作用:王莉伍亚民刘媛南国新曾琳【摘要】目的观察神经干细胞(NSCs)和丙戊酸(VPA)联合应用对成年大鼠脊髓损伤后的修复作用。方法SD大鼠随机分为单纯损伤组、NSCs移植组和NSCs+VPA治疗组。采用半切脊髓损伤模型,损伤后进行病理染色和神经诱发电位检测。结果NSCs+VPA治疗组损伤处空洞闭合情况优于其余两组,移植物和宿主脊髓建立的纤维联系较其余两组多,排列有序。NSCs+VPA治疗组诱发电位各项指标匀优于其余两组,8周时最显著,其中以运动诱发电位(MEP)的优化最明显。
2、结论NSCs和VPA联合应用对成鼠脊髓损伤具有良好的修复作用。【关键词】脊髓损伤神经干细胞丙戊酸创伤修复脊髓损伤后由于受损的神经元无法再生,而胶质细胞大量增生,严重阻碍了脊髓功能的恢复。神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植成为当前治疗脊髓损伤的热点,然而大量的研究报道,NSCs移植到体内主要分化神经胶质细胞,仍然不能较好地修复损伤脊髓。本实验通过治疗癫痫常用药丙戊酸(valproicacid,VPA)和NSCs移植联合应用,拟为解决脊髓损伤修复中存在的问题提供新的思路。材料与方法 1NSCs的培养
3、与鉴定 取体重为220~250g的E13~15天SD孕鼠(第三军医大学大坪医院动物中心提供)1只,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后消毒皮肤,打开腹腔,取出胎鼠置于冰台上。用眼科剪剪开头皮和骨,取出大脑皮层放入装有无钙平衡盐溶液(DHanks)的瓶中,再用眼科剪反复切割组织,缓慢吹打后,用细胞筛过滤制成单细胞悬液。以1000r/min离心5分钟,弃上清,加入神经元基础培养基(NB)培养液(内含N2添加剂,20ng/ml碱性成纤维生长因子,100μg/ml胰岛素,以上皆为Gibco产品),置入37℃、5%C
4、O2培养箱培养,每6~7天传代1次。应用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化单标检测试剂盒(博士德,武汉)结合巢蛋白(Nestin)抗体(Pharmigen)来检测神经干细胞中的Nestin抗原。再取培养的NSCs球经血清分化后,用神经微丝200(NF200)单克隆抗体(Sigma)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Sigma)进行SABC双标免疫组化染色。 2动物分组 成年SD大鼠,重220~250g(雌雄不拘),每个时相点6只动物,每组18只,共54只。随机将动物分为A组(单纯损伤组)
5、、B组(NSCs移植组)、C组(VPA+NSCs移植组)后行脊髓半切损伤;于手术后2、4、8周行病理染色和诱发电位检测。 3脊髓损伤模型的制作与移植治疗 用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,腰背部脱毛,将动物固定在脑立体定位仪上。无菌条件下切开T9~T11处并切除T10椎板,暴露T10脊髓,用眼科虹膜刀横断并用玻璃针捣毁并吸出右侧半脊髓,形成一约3mm×3mm×2mm大小的空洞。A组动物损伤后用90线缝合硬脊膜,逐层缝合肌肉、皮肤并肌注青霉素1万U3次/d,连续3天;B组动物在伤后于空洞处移植吸附于可吸收明
6、胶海绵上的培养、鉴定后的15μl含5×105个神经干细胞的悬液,伤口处理同A组;C组动物手术处理同B组,同时300mg/(kg·d)腹腔注射VPA,分2次注射。手术后2、4、8周,进行病理染色和运动诱发电位检测。 4标本制作及病理染色 4.1灌注、取材手术后2、4、8周,麻醉大鼠后将其固定于解剖板上,剪开胸腔、左心室插管,剪开右心耳,快速灌注生理盐水150~200ml,待流出液体清凉后,灌注4%多聚甲醛约200ml。灌注完成后,取出半切部位及其头、尾侧各3个节段的脊髓,再放入4%多聚甲醛后固定6小时。 4.2切片、
7、染色取出瓶底大体标本经修整、石蜡包埋后以10μm连续切片,按常规方法进行苏木精伊红染色(HE)、Holmes银染等病理染色。 5诱发电位检测 将受检测的动物用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,在头颅后部、右腿部剪毛,消毒皮肤。切开头颅后部皮肤,剥离骨膜,用牙科钻在左侧皮层中央后回感觉区相对应的冠状缝后3mm、正中矢状缝向左旁开1mm处钻一直径约为3mm的盲孔,并暴露手术侧(右侧)的坐骨神经。用Pos,强度4.5mA,信号经前置放大器放大10万倍,计算机平均256次)记录感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)波形曲线,
8、计算波峰和峰潜伏时。检测皮层SEP时,刺激电极位于坐骨神经,记录电极置于皮层表面,参考电极置于头皮下。检测MEP时,刺激电极与记录电极交换,参考电极位于硬腭下。健侧的测量方法同手术侧。组间比较采用t检验,并用SPSS软件进行统计学分析。 2苏木精伊红染色 损伤后第2周染色,A组损伤周围组织严重塌陷,超过半切范围
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