双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病大鼠c反应蛋白的影响

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1、双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病大鼠C反应蛋白的影响　　C反应蛋白(Creactiveprotein，CRP)是肝细胞在IL６等细胞因子作用下合成的一种急性时相反应蛋白，当机体发生炎症、损伤等应激反应时其血清水平急剧升高。研究证实CRP在２型糖尿病患者体内含量较高，且与该病及其并发症的发生、发展关系密切［1］。双歧杆菌脂磷壁酸（lipoteichoicacid，LAT）是一种重要的免疫调节剂，具有抗感染、抗肿瘤、降血脂和延缓糖尿病发生等生物学作用［2］。本实验通过研究青春双歧杆菌脂磷壁酸对２型糖尿病大鼠血清CRP含量和肝细胞CRPmRNA表达水平的影响，探讨其应用在糖尿病预防及

2、临床治疗中的可行性。　　1材料与方法　　1.1药品试剂及动物　　链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于Sigma公司；双歧杆菌脂磷壁酸：按乐军等［3］方法从青春双歧杆菌中分离纯化；大鼠C反应蛋白ELISA试剂盒购于上海卓康生物科技有限公司；Trizol,RTPCR试剂盒及DNA标准参照物购于Promega公司。　　健康雄性SD大鼠30只，清洁级，体质量110～150g，由本院实验动物中心提供。　　1．2分组及实验　　SD大鼠随机分为正常对照组（对照组），糖尿病组和不同剂量的LAT干预组，每组6只。按照穆松牛等［4］方法制备大鼠2型糖尿病模型：糖尿病组和LAT干预

3、组大鼠饲喂高糖高脂饲料３周后一次性腹腔注射STZ每公斤体质量25mg(STZ溶于柠檬酸枸橼酸钠缓冲液，所配浓度为10mg/mL)，３天后以比色法测定空腹血糖值；空腹血糖值≥17.0mmol/L即为２型糖尿病稳定模型。LAT干预组大鼠分别腹腔注射1.0，2.0，4.0μg的双歧杆菌脂磷壁酸（LAT溶于5ml生理盐水中），每天1次；糖尿病组和对照组注射同等剂量的生理盐水，6周后开始实验。　　1.3ELISA法检测血清CRP含量　　大鼠实验前12h禁食不禁水，处死后心脏取血并分离血清，按照试剂盒说明测定血清CRP含量。　　1.4RTPCR法检测肝细胞CRP基因表达　　分离大鼠肝脏，T

4、rizol法提取肝细胞总RNA。CRP和内参GAPDH引物合成：CRP（326bp）上游引物：5′TATTTTCTCGTATGCCACCA3′，下游引物：5′TTTCCAATGTCTCCCACCAG3′；GAPDH（541bp）上游引物：5′TTAGCACCCCTGGCCAAGG3′，下游引物：5′CTTACTCCTTGGAGGCCATG3′。RTPCR法检测CRP基因表达：按照逆转录试剂盒说明进行。取5μlPCR产物1.5%琼脂糖电泳并用凝胶成像系统检测。　　1.5统计学处理　　样本PCR产物电泳条带灰度分析采用BandLeader3.0软件，以CRP/GAPD

5、H灰度比值表示CRP表达水平；数值均以±s表示，采用SPSS12.0软件包进行统计学分析，组间比较采用方差分析。　　2结果　　2．1大鼠2型糖尿病模型　　糖尿病组和LAT干预组大鼠均出现明显的多食、多饮、多尿、体质量下降症状；比色法测定空腹血糖值均≥17.0mmol/L。　　2．2血清CRP含量　　糖尿病组和对照组大鼠血清CRP含量分别为(5.67±0.13)mg/L和(1.96±0.13)mg/L，两者间差异有统计学意义(P<0.05）；LAT干预组大鼠血清CRP含量比糖尿病组低，随LAT浓度增加CRP含量降低，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05），结果见表

6、1。　　2.3肝细胞CRP基因表达　　糖尿病组大鼠肝细胞中CRP/GAPDH(灰度比)高于对照组，不同剂量的LAT干预组大鼠肝细胞中CRP/GAPDH(灰度比)均比糖尿病组低，呈浓度依赖性，两组间差异有统计学意义（P<0.05）；结果见表1，图1，图2。表1双歧杆菌脂磷壁酸对2型糖尿病大鼠血清CRP及肝脏CRPmRNA表达的影响（略）。　　3讨论　　糖尿病是由多种原因引起的以慢性血糖升高和（或）伴有多器官系统损害为主要特征的一种内分泌代谢紊乱疾病，其病因与发病机制尚不明确。近年来，炎症学说在2型糖尿病发病进程中的促进作用备受国内外学者的广泛关注［5-6］。　　本实验结果中糖尿

7、病组大鼠血清内的CRP含量明显高于正常对照组和双歧杆菌脂磷壁酸干预组。CRP作为一种显示系统炎症进展程度的非糖基化聚合蛋白，是炎症急性时相蛋白中最敏感的指标，在多种病理生理过程中起媒介作用［7］。2型糖尿病患者的血清中往往含有多种高水平的炎性细胞因子，它们都直接和（或）间接地促进该病及其并发症的发生，其中以CRP的作用尤为显著［1］。Wang等［8］证实CRP可以通过NFκB途径激活多种炎症相关基因的表达和炎症介质的释放，进而引起血管内皮功能紊乱。CRP可以促进脂类