硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞增殖的影响

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1、硫酸氨基葡萄糖对大鼠软骨细胞增殖的影响【关键词】硫酸氨基葡萄糖；大鼠；软骨细胞；增殖AbstractObjective:Thepurposeofthepresentpaperinsulphat(GS)ontheproliferationofratchondrocyteinvitro.Methods:Theratarticularchondrocytesedigestionandsub-cultivatedinserial.The4thchondrocyteedicineinteferedgenerationethodsasPA(proliferatingcellnuclearanti

2、gen),MTT(methylthiazolyltetrazolium)assayforproliferationandFloetryforanalysesofcellcycledistributionandPI(proliferationindex).Results:TTassayshoentofimmunohistochemistry,asetryforanalyses.GScaninhibitthetendencyandstrengthenedtheproliferatingabilityofchondrocytesinserialsubcultivation.Conclusi

3、on:GScansignificantlyimproveproliferationofchondrocytesinserialsubcultivation.Keyinsulphat(GS);Rat;Chondrocyte;Proliferation关节软骨缺损是临床上的常见损伤，它可导致关节面不平整，从而继发骨性关节炎。用组织工程软骨修复关节软骨缺损是目前正在尝试的一种新方法，具有良好的发展潜力。关节软骨细胞是组织工程理想的种子细胞，但如何分离获取数量多、活性高、分化良好的软骨细胞是组织工程培养技术中的重要问题之一。近年来对生长因子在关节软骨形成和退变过程中的作用日益受到重视，并开展

4、了广泛的研究，认为种子细胞需要适应生长因子的调控才能获得良好的生物活性。硫酸氨基葡萄糖是关节软骨生物合成和刺激合成聚氨基葡萄糖及透明质酸骨架的基本物质，被认为是第一个改变骨关节炎病情的药物。本研究采用体外培养大鼠软骨细胞的方法，观察硫酸氨基葡萄糖对其增殖的影响，为优化组织工程的种子细胞提供一定的理论和实验依据。　　1材料　　1.1实验动物　　清洁级SD（Sprague-Daersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；噻唑蓝（MTT，上海申能博采公司），二甲基亚砜(Amersco公司)；增殖细胞核抗原(PA，美国NeoMarkers公司)；硫酸氨基葡萄糖(

5、浙江海正药业)。　　2方法　　2.1大鼠软骨细胞的获取、鉴定与药物干预分组情况　　取4周龄体重185～200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等［1］软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3日首次换液，8～10天达85%融合后进行传代培养。以传代次数（passage，P）分组，P0即原代细胞，P1即第1次传代后细胞，P2即第2次传代培养细胞，余类推。软骨细胞鉴定采用阿力新蓝染色法检测GAG合成、免疫组化法及RT－PCR法检测Ⅱ型胶原表达［2］。实验分组为P2组、P3组、P4组及硫酸氨基葡萄糖不同剂量组（低、中、高不同药物浓度干

6、预后的P4软骨细胞组），硫酸氨基葡萄糖干预组分组的方法采用传代分组法：倒置相差显微镜下进行观察，当P3代软骨细胞融合达到85%时进行传代（1传3），以胰酶消化贴壁细胞，反复吹打，使细胞均匀悬浮，离心（1500rpm，5min），洗涤2次；对αMEM（含5%FBS）进行加药，配制含不同浓度的GS培养基，分别加药使各瓶培养基药物终浓度为GS5mg/mL、GS10mg/mL、GS15mg/mL；分别以上述不同含药浓度培养基吹打混匀各瓶P3细胞，进行传代，使药物干预组软骨细胞进入P4代。按实验要求调整细胞浓度，分别接种软骨细胞于底面积25cm2培养瓶（细胞浓度5×105/mL）、6孔培养板（

7、置入盖玻片，细胞浓度5×105/mL）、96孔培养板（细胞浓度4×105/mL），于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中孵育，其中硫酸氨基葡萄糖分组参考剂量于LargoR等［3］、MatteiM等［4］及DodgeGR等［5］实验研究。　　2.2各代软骨细胞MTT比色试验　　将不同代次大鼠软骨细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24h后用含体积分数为5%FBS的αMEM培养，分别加入硫酸氨基葡萄糖，使硫酸氨基葡萄糖终浓度为5、10、15m