利凡诺对b16黑色素瘤细胞生长及mmp.2、mmp.9表达的影响

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1、利凡诺对B16黑色素瘤细胞生长及MMP.2、MMP.9表达的影响　　［关键词］利凡诺;B16黑色素瘤细胞;基质金属蛋白酶;转移　　利凡诺（ethacridine）是临床常用的皮肤黏膜消毒剂和中止妊娠药，本研究组已经发现其对S.180腹水瘤（小鼠腹水瘤）和实体瘤都有明显的抑制作用1］。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是一种降解细胞外基质的蛋白酶，在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用，尤其是MMP.2和MMP.92］。目前尚不清楚利凡诺能否通过影响肿瘤细胞MMPs的表达而抑

2、制肿瘤的转移，我们通过观察利凡诺对体外培养的B16黑色素瘤细胞生长状态及MMPs表达的影响，进一步探讨利凡诺抑制肿瘤细胞生长的机制以及其临床应用的可能性。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞培养及处理B16黑色素瘤细胞株（购自中国科学院上海细胞生物研究所）接种于含10%小牛血清和100U・ml-1青霉素、100mg・ml1链霉素的RPMI1640培养液中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。实验时选取对数生长期的细胞，用0.2

3、5%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化制成单细胞悬液。　　1.1.2利凡诺的配制及细胞分组每次实验加药前取利凡诺注射液［50mg・（2ml）-1，江苏天禾制药有限公司，批号0306041］，用含5%小牛血清的RPMI1640培养液将其稀释至浓度分别为3.13、6.25、12.5μg・ml-1（按体积比为18000、14000、12000稀释）后立刻使用。细胞分组为:（1）对照组，加入与实验组等体积的RPMI1640培养液;（2）实验组，按利凡诺的浓度分为3.13、6.25、1

4、2.5μg・ml-1共3组。　　1.2方法　　1.2.1细胞生长的形态学观察选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，用RPMI1640培养液稀释，细胞浓度为6×104ml-1，置于饱和湿度、37℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养，贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.1.2）。加药后于24、48和72h用相差显微镜观察细胞形态。实验同时选取对数生长期的内皮细胞（ECV304，人脐静脉内皮细胞）作为对照，制成细胞浓度为6×104ml1的单细胞悬液，按照相同方法处理。　

5、　1.2.2噻唑蓝（MTT）法选取对数生长期的细胞调节细胞浓度为6×104ml-1，接种于96孔培养板内，待细胞贴壁并生长状态良好后按照对照组与实验组进行药物处理（见1.2.1），药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后每孔加入20μlMTT（质量浓度为5g・L1，用0.01mol・L-1的PBS配制）继续培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，在酶标仪（MultiskanMK3.353）492nm处测定光吸收值（A），每组设6个平

6、行孔，取平均值，按以下公式计算细胞生长抑制率（P）:P=（对照孔A492-实验孔A492）/对照孔A492×100%实验同时选取对数生长期的内皮细胞作为对照，制成细胞浓度为6×104ml-1的单细胞悬液，按照相同方法处理。1.2.3酶联免疫吸附（ELISA）法采用双抗体夹心法。细胞准备和药物处理方法同上，药物处理后在同样条件下培养24、48和72h后吸取培养板内的培养上清，测培养上清中MMP.2蛋白相对含量。兔抗人MMP.2抗体（DrStetlerStevenson馈赠）工作浓度为11000，鼠抗人MMP.

7、2抗体（购自福州迈新试剂公司）工作浓度为110000，羊抗兔IgGHRP的工作浓度为15000，培养上清未经稀释，四甲基联苯胺（华美公司）显色，2mol・ml-1H2SO4终止反应。阴性对照以新鲜无血清培养液代替培养上清。酶标仪（Multi-skanMK3.353）450nm处测定A值，以此代表蛋白相对含量。　　1.2.4免疫细胞化学染色（ICC）采用标记链霉素卵白素生物素（SP）法。选取对数生长期细胞经药物处理方法同1.2.1）后培养24h，然后用PBS冲洗3次，冷丙酮固定8min，晾干。M

8、MP.2兔抗人多抗（SantaCruz产品）工作浓度为150;MMP.9羊抗鼠单抗（SantaCruz产品）工作浓度为1100，DAB显色。阴性对照为不加一抗以PBS代替的细胞片。计数细胞爬片固定方位的5个高倍视野内（玻片之左、中、右3区共取5个视野）细胞总数及阳性细胞数，后者按染色强度分弱、中、强3级，分别以1、2、3赋值。以平均每视野赋值后的阳性细胞指数（5个视野阳性细胞赋值之和除以5）的均数作比较［3，4］