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《家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pgbkt7》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pGBKT7【摘要】目的构建能在酵母菌AH109中表达的mSOD1cDNA的穿梭表达质粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突变SOD1编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。方法通过PCR法以真核表达载pEGFP-mSOD1cDNA为模板，扩增获得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA结合域的片段，经过SalⅠ、EcoRⅠ双酶切后，基因重组的方法定向亚克隆于酵母双杂交载体pGBKT7中，构建形成pGBKT7-mSOD1真核表达载体。结果经转化，提取质粒双酶切，核苷酸测序，BALST比对
2、鉴定表明构建成功。结论成功构建穿梭质粒pGBKT7-mSOD1cDNA，为深入研究突变的SOD1基因编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。【关键词】酵母双杂交载体亚克隆mSOD1cDNApGBKT7 Abstract:ObjectiveToConstructofpGBKT7mSOD1YeastTilialamyotrophiclateralsclerosisandtostudyProteinproteininteractionsofmutationSOD1encodeprotein.Methodsn-S
3、OD、Fe-SOD，哺乳类动物体内，仅含有Cu,Zn-SOD与Mn-SOD。分布在胞浆中Cu,Zn-SOD，称为SOD1；分布于线粒体中Mn-SOD，称为SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD称为SOD3,其中SOD1是细胞中高水平表达的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小组在对一个肌萎缩侧索硬化症家系致病基因的研究中发现［2］，SOD1第二号外显子出现突变，测序分析证实第2号外显子编码区插入了一个碱基A，第2外显子的插入突变导致SOD1转录和翻译时阅读框改变，结果SOD1翻译提前终止，研究小组把这108个碱基
4、对的cDNA暂命名为mSOD1cDNA,提交GenBank，获得的编号是EF143990。本文报告载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建，为研究mSOD1基因突变编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1主要试剂：限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶购自大连Takara公司。DNA连接试剂盒购自美国MBI公司，卡那霉素购自上海华美公司，质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司。 1.1.2菌株和质粒：pGBKT7购自美国BDClontech公司，pEGFP
5、-mSOD1为本课题组提供，大肠杆菌DH5α为烧伤研究所提供。根据mSOD1cDNA的序列设计引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5'-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3',pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5'-gacGTCGACATGCTTCCCCACACCTTCATCT-3'，引物由上海生工生物科技有限公司合成。 1.1.3仪器设备：台式离心机(上海安亭科仪厂生产)，PCR仪(美国Bio-Rad公司生产)，电泳仪(美国Bio-Rad公司生产)，手提紫外灯(美国
6、Upland公司生产)，凝胶成像仪系统GelDoc2000(美国Bio-Rad公司生产) 1.2方法 1.2.1PCR反应：以pEGFP-mSOD1cDNA为模板，无核酸酶去离子水36.5μL，10×PCR buffer(mg2+free)5μL,dNTP(2.5mM)4μL,Mgcl2(25mM)3μL,上游引物0.5μL，下游引物0.5μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)0.5μL,总反应体系50μL。扩增条件：94℃预变性5min，紧跟30个循环，每一个循环94℃变性30s,55℃复性30s，72℃延
7、伸30s,最后72℃延伸10min补齐末端。 1.2.2PCR产物电泳及低熔点琼脂糖凝胶回收和纯化：取PCR反应物5μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约120bp的片段。取余下的PCR产物45μL行1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，并测序。 1.2.3mSOD1酵母双杂交表达载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建：分别以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pGBKT7和mSOD1回收纯化酶切片段及线性化载体，在T4DNA连接酶的作用
8、下连接，连接产物转化感受态细胞Ecoli.DH5α,将pGBKT7-mSOD1cDNA转化的细胞接种于卡那霉素选择培养基上，37℃培养12～16h，挑出阳性菌落摇菌，采用小质粒提取试剂盒提取质粒，以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。 1.2.4载体pGBKT7-mSOD1cDNA测序和BLAST比对。 2结果 2.1mSOD1cDNA片段的扩增以含有mS
