利用trizol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总rna

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1、利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA：李冬民，任吴超，王璇，王飞苗，高玉，韩燕，宁启兰，宋天保，吕社民【摘要】　　目的建立胰腺高质量总RNA快速、经济、稳定的提取方法。方法应用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺总RNA，通过总RNA含量和A260/280比值的测定及10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的质量，并用RTPCR检测大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶和βactin的表达。结果利用TRIzol和液氮提取的大鼠胰腺总RNA量可达到3～6μg/mg胰腺组织，A260/280比值在1.75～1.89

2、之间。在10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时，均可见28S及18S条带，并且在28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α淀粉酶、βactinRTPCR产物电泳结果显示均有清晰的条带。结论应用TRIzol试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总RNA，后者可用于RTPCR研究。【关键词】大鼠胰腺；总RNA提取；TRIzol试剂；液氮　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishaquick,economicalandreproduciblemethodforhighqualityRN

3、Aextractionfrompancreas.Methodstheratpancreas.TheRNAqualityinedbydetectionofitscontentandopticdensity(A)at260/280nm,andelectrophoresisin1%nondenaturedagarosegel.Thenreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)edtodetectexpressionofthepancreasspecificgenes.Resul

4、tsThecontentofthetotalRNAextractedfromtheratpancreasreached3-6μg/mgpancreatictissues,andA260/280ratioearbet.TheRTPCRproductsofpancreasspecificgenesincludinginsulin1,glucagon,αamylaseandhousekeepinggeneβactinallexhibitedclearbandson1%agarosegel,theratpancreasentas公司)；

5、TaqDNApolymerase(TaKaRa公司)。蛋白核酸定量仪CE231(GENEGUEST)；凝胶成像系统(SYNGENE)；PCR热循环仪PTC200(BIORAD)。用PrimerPrimier5.0设计PCR引物，并由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列见表1。表1大鼠胰腺中表达的4个基因的引物序列和扩增片段大小（略）　　1.3大鼠胰腺的取材和保存　　取材所用的器械180℃干烤6h，不能干烤的塑料制品用1mL/LDEPC水37℃处理过夜，高压烤干后备用。戊巴比妥钠麻醉E3大鼠，快速取胰腺尾部组织约20～30mg，装

6、入DEPC处理过的冻存管中，液氮中保存或液氮速冻后-80℃保存备用。　　1.4利用TRIzol和液氮提取大鼠胰腺总RNA　　将胰腺组织从液氮或-80℃低温冰箱中取出，立即放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末，研磨过程中始终保持研钵内有液氮。然后，将胰腺组织粉末移入1.5mL的EP管中，加入1mLTRIzol，剧烈震荡30s，并在室温放置5min。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min，4℃12000×g离心15min，样品分为3层：上层无色水相，下层粉红色有机相，中间白膜层。将上清转移至另一新的DEPC处理过的1.5

7、mLEP管中(此步绝对不能吸入中间白膜层)，加入0.5mL异丙醇，混匀后-20℃放置30min。4℃12000×g离心10min，弃去上清，用750mL/L乙醇洗涤RNA胶样沉淀。4℃7500×g离心5min，室温放置10～15min干燥，加入60μLDEPC水溶解RNA沉淀后80℃保存。若长期保存，RNA也可用无RNA酶的去离子甲酰胺溶解。　　1.5大鼠胰腺总RNA定量及A260/280比值鉴定　　用99μLDEPC水稀释总RNA1μL后，用核酸/蛋白质微量定量仪检测大鼠胰腺总RNA的含量及A260/280比值。　　1.610g/L

8、非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰腺总RNA　　电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用30mL/L过氧化氢溶液浸泡30min，用DEPC水冲洗3遍，室温晾干备用。用对RNA酶有抑制作用的DEPC水配