抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

《抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定：汪治华,张国成*,许东亮,孙新,李小青,李思袖,张学红,聂晓晶,豆玉凤【摘要】目的:构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库,搭建人源性抗体制备的技术平台,为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径。方法:从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA,并逆转录为cDNA。用PCR扩增轻链和重链Fd段（即重链的可变区和第一恒定区）基因,并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pb3x噬粒载体,电转化XL1Blue大肠杆菌,经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库。对

2、此抗体库双酶切进行鉴定,并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。结果:经过重轻链基因的重组,成功构建一免疫噬菌体抗体基因库,共有2.6×106个不同的克隆菌,其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd基因。因此,所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106,经初步筛选,抗体库得到了不同程度的富集。结论:利用基因重组技术和噬菌体展示技术,成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库,为进一步的研究奠定了基础。【关键词】抗体库;噬菌体展示技术;Fab抗体;呼吸道合胞病毒;儿童随着分子生物学的发展,基因工程抗体技术的出现,尤其是噬菌体抗体库技术,为各种不同免疫原人源性抗体的制

3、备提供了新途径,成为抗体工程领域革命性的进展［1］。我们以52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因,成功地构建了一个人源性Fab段免疫噬菌体抗体库,并对其进行了初步鉴定,为研制诊断、治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础,同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。1材料和方法1.1材料选取52例经ELISA法检测呼吸道合胞病毒IgM和/或IgG抗体阳性的患儿,每例患儿抽取血液2mL,共约100mL。噬粒载体pb3x（含氨苄青霉素抗性基因）,大肠杆菌菌珠XL1Blue（带四环素抗性基因）,辅助噬菌体M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四军医大学李郁

4、博士惠赠。焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司,TRIzol购自Invitrogen公司,RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司,TaqDNA聚合酶和T4DNA连接酶购自TaKaRa公司,限制性内切酶SpeI、XhoI、SacI、XbaI购自Promega公司,呼吸道合胞病毒Long株（RSVLong）,由本实验室保存。1.2方法1.2.1淋巴细胞的分离和总RNA的提取用淋巴细胞分离液分离约100mL外周血淋巴细胞,用TRIzol法提取总RNA,取适量进行甲醛变性胶电泳并用分光光度计测A值以鉴定RNA的质量。1.2.2轻链基因和重链Fd段基因的扩增PCR引物设计及扩增参照

5、文献［2］,共23条引物,由GenerayBiotech公司合成。按RNA逆转录试剂盒中的说明,将总RNA逆转录为cDNA,以其为模板,PCR扩增轻链及重链Fd段基因,扩增条件为:94℃50s,55℃50s,72℃1min,共30个循环;并分别引入酶切位点SacI+XbaI和SpeI+XhoI。将全部抗体基因产物经琼脂糖凝胶电泳回收。1.2.3轻链基因库和Fab段抗体基因库的构建及鉴定轻链基因的扩增产物经SacI和XbaI双酶切后回收,与经同样酶切回收的pb3x载体片段相连接,并电转化E.coliXL1Blue感受态菌,构建轻链基因库。取适量菌液稀释后,接种于SOBAG琼脂平

6、板（含氨苄青霉素100mg/L,葡萄糖20g/L）,以测定转化率,并随机挑选10个单克隆菌,酶切鉴定轻链库的重组率。其余菌液扩大培养后提取质粒,经SpeI和XhoI双酶切,回收带有多样性轻链基因的载体大片段;Fd段重链基因也以SpeI和XhoI双酶切后回收,用T4DNA连接酶将回收的两种基因片段连接,将连接产物电转化E.coliXL1Blue,其余构建Fab段抗体基因库步骤同轻链基因库的构建。1.2.4Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选将Fab段抗体基因库的菌液转入SBA+T+液体培养基（含100mg/L氨苄青霉素和10mg/L四环素）中37℃振荡培养2h,然后按1×10

7、12pfu/100mL加入辅助噬菌体M13K07和卡那霉素（终浓度70mg/L）,于37℃培养过夜。次日,将扩大培养的菌液于4℃以4000r/min离心15min,加入40g/LPEG8000沉淀,用含有10g/LBSA和100g/L甘油的PBS重悬沉淀,瞬时离心,取上清即为噬菌体抗体库。用纯度为1×1015/L的Long株RSV颗粒作抗原进行初步筛选,将RSV包被于96孔板于4℃过夜,次日,PBS洗涤后,用30g/LBSAPBS封闭,于37℃孵育1h。将上述噬菌体抗体库溶液加入96孔板于