罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展

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1、罗格列酮延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展【摘要】目的：观察罗格列酮对糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对骨转录因子Msx2表达的影响。方法：在高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射处理的基础上，加用维生素D3和尼古丁处理，制备糖尿病合并血管钙化大鼠模型(糖尿病合并血管钙化组)，给予部分糖尿病合并血管钙化组大鼠罗格列酮灌胃(2mg·kg-1，每天1次，共8周)处理(罗格列酮组)，同时设立空白对照组。实验第21周末，处死各实验组大鼠，检测各组大鼠的代谢指标，进行血管vonKossa染色，检测血管钙含量和碱性磷酸酶活性，应用realtimePCR方法检测Msx2mRNA及蛋白免疫印迹方法检测Msx

2、2蛋白在血管中的表达变化。结果：与对照组相比，糖尿病合并血管钙化组大鼠血管内存在弥漫性的钙盐沉积，血管内钙含量增高,碱性磷酸酶活性增强，Msx2mRNA和蛋白表达明显增高(均P<0.05);而给予罗格列酮处理后，钙盐在血管内的沉积明显减少，钙含量和碱性磷酸酶活性分别下降8.37%、10.59%，Msx2mRNA和蛋白表达也分别下降36.73%、42.55%(与糖尿病合并血管钙化组相比,均P<0.05)。结论：罗格列酮可以延缓糖尿病大鼠血管钙化的发展，并可以减少钙化血管中Msx2的表达。【关键词】2型糖尿病;血管钙化;转录因子Msx2;罗格列酮;大鼠与非糖尿病患者相比，2

3、型糖尿病患者易于发生大血管钙化。血管钙化是指钙磷病理性地沉积在血管壁上。根据其在血管壁上沉积的部位不同，分为内膜钙化和中膜钙化。目前中膜钙化已经成为心血管疾病死亡率的独立预测因素[1]。中膜钙化主要表现为沿中膜弹力层的钙盐沉积，导致血管僵硬度增高和顺应性下降。血管僵硬度的增高则进一步导致心脏做功、脉搏压和脉搏波速度增加，最终引起血管膨胀受损，左室肥厚和冠脉灌注减少[2]。Msx2(mshhomeoboxhomolog2)是骨形成蛋白2(bonemorphogeicprotein2,BMP2)下游的一个转录因子，主要调控膜内成骨的发生。Cheng等[34]研究结果显示，Msx

4、2可以调节血管外膜的成肌纤维细胞向成骨样细胞表型分化，诱导血管钙化的发生。本实验即通过建立糖尿病合并血管钙化的大鼠动物模型，观察罗格列酮对于糖尿病大鼠钙化血管的治疗作用及对Msx2表达的影响。　　1材料和方法　　1.1材料　　6周龄雄性sx2山羊抗大鼠多克隆抗体购自美国SantaCruz公司，βactin兔抗鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和兔抗山羊IgG购自北京中衫金桥生物技术有限公司;ECLPlus检测试剂盒购自英国GEHealthcare公司;所用其它试剂均系市售分析纯产品。　　1.2动物模型制备　　将30只雄性g·kg-1)，

5、建立2型糖尿病模型。对照组大鼠予等量柠檬酸钠溶液腹腔注射。1周后参照Niederhoffer等[5]报道的方法，对糖尿病合并血管钙化组和罗格列酮组大鼠制备钙化模型：上午8:00给予维生素D3(300000U·kg-1)肌肉注射，尼古丁溶于花生油(质量浓度为25mg·kg-1)按5ml·kg-1灌胃，晚上20:00给予尼古丁重复灌胃1次。予对照组大鼠等量生理盐水肌肉注射和单纯花生油灌胃处理。4周以后，给予罗格列酮组大鼠罗格列酮2mg·(kg·d)-1灌胃8周，予糖尿病合并血管钙化组和对照组大鼠生理盐水灌胃。于实验第21周末，注射过量戊巴比妥钠处死动物，经心脏采血留取血标本，摘取胸、腹

6、主动脉用生理盐水冲洗后称质量，于-80℃贮存备用。　　1.3代谢指标检测　　各组大鼠的血糖(glucose,Glu)通过葡萄糖氧化酶法检测，利用Randox公司的比色法试剂盒检测血总胆固醇(cholesterol,Cho)和甘油三酯(triglyceride,TG)含量，血胰岛素(insulin,Ins)水平利用Linco公司的放免试剂盒检测。所有操作重复3次。　　1.4vonKossa染色　　取大鼠胸主动脉段约0.5cm，在10%福尔马林溶液中固定后石蜡包埋，制作6μm厚切片，常规脱蜡、脱水。浸入5%硝酸银溶液，在日光下照射30min后用蒸馏水清洗数遍，将切片置于5%硫代硫酸钠溶

7、液中1min后蒸馏水清洗数遍，用1%伊红染色复染数秒钟。脱水、透明后封片，光镜观察，拍照。　　1.5钙含量和碱性磷酸酶活性检测　　取主动脉组织(约10mg)于55℃彻底烘干，加入10%甲酸(按30μl·mg-1组织干重)，4℃过夜。按照钙检测试剂盒说明书操作，利用比色法检测血管组织中的钙含量[6]。　　取-80℃贮存的主动脉组织，加入PBS后制备匀浆，12000×g离心10min，上清液利用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。血管组织中碱性磷酸酶活性按照试剂盒说明书检测，碱