以纤维蛋白凝胶为支架构建组织工程胃新膀胱的研究

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1、以纤维蛋白凝胶为支架构建组织工程胃新膀胱的研究作者：杨中华，王行环，王怀鹏，罗耀雄，刘久敏【摘要】目的探讨以纤维蛋白凝胶为支架，通过组织工程技术以胃重建膀胱的可行性。方法从实验动物获取膀胱黏膜，体外培养并扩增移行上皮细胞。分别通过纤维蛋白凝胶(实验组)和keratinocyteSFM(对照组)将单个细胞悬液移植于带血管蒂的去黏膜胃片，将胃片缝成囊状(新膀胱)，固定于腹壁。于术后2、4、6、8周取胃片进行组织学及免疫组化分析。结果实验组术后随时间延长新膀胱有不同程度挛缩；HE染色提示胃囊腔面有上皮样细胞覆盖，2周时细胞覆盖率约50%，4-8周

2、时约70%。这些细胞分布不均匀，分层不明显；上皮样细胞AE1/AE3染色和CK7染色均阳性。对照组各标本均严重挛缩，腔隙消失，无上皮覆盖。结论将体外培养扩增的尿路上皮细胞通过纤维蛋白凝胶移植至去黏膜胃片，可以使去黏膜胃片移行上皮化，从而重建膀胱。【关键词】纤维蛋白凝胶；移行上皮；组织工程；膀胱成型术StudyontheconstructionofgastricbladderusingfibringlueasthetissueengineeringscaffoldABSTRACT:ObjectiveToexplorethefeasibility

3、ofconstructinggastricbladderusingfibringlueasthetissueengineeringscaffold.MethodsUrothelialcellsopenbladderbiopsiestakenfrom17pigs.Thesinglecellsentalgroup)andkeratinocyteSFM(controlgroup)respectively,andthenucosalizedstomachtissuebasedontherightgastroepiploicartery.EM(Gib

4、co)中送实验室。用可吸收线双层缝合膀胱，证实无尿液渗漏后关闭腹腔。无菌条件下剥离膀胱黏膜，用含500u/mL青霉素/链霉素(Hyclon)的PBS液反复清洗并将黏膜剪成糊状，置入三角瓶中，加入30-50倍体积的200u/mL胶原酶Ⅰ(Gibco)，室温搅拌消化60-90min，100目筛网过滤，1000r/min离心3min，弃上清，PBS清洗后将细胞接种于T25培养瓶以keratinocyteSFM(Gibco)培养(37℃、5%CO2)。待细胞达80%－90%融合时以1∶2传代，继续培养。细胞爬片：用40g/L多聚甲醛固定，以抗角细胞

5、广谱角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)(福建迈新)为一抗，以DAB为底物，应用免疫过氧化物酶法显色。1.2移行上皮细胞纤维蛋白原悬液的制备当细胞生长达足够数量后以2.5g/L胰酶消化，离心，清洗，获取单个细胞悬液，细胞计数及台盼蓝活性检测。将纤维蛋白凝胶两种成分纤维蛋白原和凝血酶原分别溶解于2.5mLPBS和同体积的氯化钙溶液，实验组以凝血酶原溶液重悬单个细胞，对照组以keratinocyteSFM重悬单个细胞，备用。1.3去黏膜胃片的制作再次麻醉动物，取上腹部正中切口，仔细游离胃网膜血管弓，保留胃网膜右血管蒂，切取胃体部楔形胃片，面积约1

6、2-18cm2；以1号和4号丝线间断双层缝合胃切缘，以恢复其连续性。用75%(体积分数)的乙醇清洗楔形胃片黏膜面，生理盐水多次清洗后，用电刀将黏膜层和黏膜下层剥除，电凝止血，生理盐水再次清洗。1.4移行上皮细胞的自体移植证实去黏膜胃片无胃黏膜残留后彻底止血，测量胃片面积。将含细胞的纤维蛋白原溶液和凝血酶原溶液通过双联注射器同时喷涂于去黏膜胃片(图1)，约1min后纤维蛋白凝胶凝固。将去黏膜胃片对折(黏膜面朝内)缝合成囊状后固定于腹壁，注意避免血管蒂扭转。对照组则将细胞悬于4mLkeratinocyteSFM中，待胃片缝合成囊状后注入。术后禁

7、食24h，随即给予正常饮食。术后3d内注射青霉素。分别于细胞接种后2、4、6、8周处死动物(每组4只，对照组和实验组各半)。取回已种植移行上皮细胞的胃囊(新膀胱)，展开胃片测量其表面积后，10%(体积分数)甲醛固定，48h后切片进行HE染色以及免疫组化染色(CK7)(福建迈新)。2结果试验广西长白猪17头，一只死于麻醉意外，其余动物生长良好，无营养不良。2.1细胞培养和鉴定原代及传代培养细胞在6-8d左右达90%融合。平均每膀胱组织标本可以获得尿路上皮细胞数量约3.2×105(2.8×105-3.6×105)，经过原代和一次传代培养后可获得尿

8、路上皮细胞约3.2×106-4.5×106，在细胞重悬于纤维蛋白凝胶溶液时其活性在87%以上。该细胞抗广谱角蛋白免疫组化染色(AE1/AE3)可见胞浆呈棕黄色，胞核