应用蛋白质组学技术研究hl60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异

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1、应用蛋白质组学技术研究HL60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异作者：胡建达林敏辉陈鑫基刘庭波魏天南李静吕联煌【摘要】目的比较人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的细胞（HL60/ADR）的整体蛋白表达谱，以期获得人髓系白血病细胞的耐药相关蛋白。方法提取HL60细胞和HL60/ADR细胞的总蛋白，采用荧光差异显示的双向凝胶电泳技术（DIGE）比较分析差异表达蛋白；经胶内酶解，MALDITOF/TOF质谱分析，搜索蛋白质数据库，获得差异蛋白质的信息。结果经过初步筛选和质谱分析共获得16

2、个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中13个在HL60细胞中表达上调，3个表达下调。主要是代谢酶类、DNA修复、信号转导相关蛋白、细胞周期调节蛋白和细胞增殖与凋亡等相关的蛋白。结论根据人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达谱比较，筛选出耐药相关蛋白。【关键词】HL60白血病细胞；白血病；电泳，凝胶，双向；蛋白质组学；多药耐药相关蛋白质类白血病是一组异质性造血系统恶性肿瘤，目前的治疗方法仍以化疗为主，近年来白血病的治疗已经取得了较大的进展，但是对化疗药物产生耐药依然是

3、大多数白血病治疗失败的主要原因。多药耐药（multidrugresistance，MDR）是耐药的主要机制之一，但可能仍存在其它耐药相关机制尚未被了解[12]。为了更好地了解在耐药发生过程中蛋白质所发挥的作用，笔者应用人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的HL60细胞（HL60/ADR）作为模型，采用蛋白质组学研究技术——荧光差异显示的双向凝胶电泳（tensionaldifferenceingelelectrophoresis,2DDIGE）比较两者间表达蛋白的差异，旨在从蛋白质整体水平

4、对细胞耐药现象发生后产生的相关蛋白变化进行研究，探讨耐药产生的机制，为进一步寻找逆转耐药的新靶点奠定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1主要试剂和仪器考马斯亮兰R350（瑞典AMERSHAM），十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED（美国BioRad）。EttanIPGphor等电聚焦系统（瑞典AMERSHAM），HoferSE600（瑞典AMERSHAM），扫描仪（GS710，美国BioRad）。1.1.2细胞株人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞引自中国医

5、学科学院天津血液病研究所。1.2方法1.2.1细胞培养2株细胞分别在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。1.2.2样品的制备和定量收集生长良好、对数生长期的HL60细胞和HL60/ADR细胞各1×107，离心（1000r/min，5min），弃上清，加入适量的PBS洗涤，再离心（1000r/min，5min），重复3次，获得洗涤后的细胞。每管加入200μLDIGE裂解缓冲液[7mol/LUrea，2mol/L硫脲，4%CHAP

6、S，0.2%固相pH梯度(immobilizedpHgradients,IPG)缓冲液，罗氏混合酶抑制剂]，冰浴超声破碎（80ALDITOF/TOF质谱，软件分析数据，鉴定蛋白质。1.3统计学处理蛋白质表达谱的差异用Student′st检验。2结果2.1DIGE凝胶图谱通过双向凝胶电泳，在HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异表达蛋白DIGE凝胶图谱中可见所表达的蛋白点数多，分布均匀且清晰，经过DIGE标记，筛选出在HL60细胞和HL60/ADR细胞之间表达差异的蛋白点，可以用于下一步的质

7、谱分析（图1）。2.2MALDITOF/TOF质谱鉴定切下HL60绿色框内为差异蛋白点的位置;黄色框内为差异蛋白点的编号.细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白点进行酶解，采用质谱分析技术MALDITOF/TOF鉴定，差异蛋白点的性质见表1。表1经MALDITOF/TOF质谱鉴定的差异表达蛋白2.3差异表达蛋白质的归类经过初步筛选和质谱分析共得到18个表达差异的蛋白点，其中有2个差异蛋白点经鉴定属于同一种蛋白质（蛋白点940和955同为mutantbetaactin，蛋白点1536和1538

8、同为nucleolarphosphoprotEinB23），因此，通过比较HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达，最终得到16个具有统计学意义的表达差异蛋白点（均P<0.001），其中13个在HL60/ADR细胞中表达上调（以“+”号表示），3个表达下调（以“-”号表示）。它们主要是代谢酶类以及与DNA修复、细胞信号转导、细胞周期调控、细胞增殖和凋亡有关的蛋白质。3讨论MDR是指肿瘤细胞在接触一种抗肿瘤药产生耐药性后，对未接触过的、