应用dna微阵列技术研究三氧化二砷对rpmi 8226细胞的作用

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1、应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷对RPMI8226细胞的作用作者：王梦昌，刘陕西，刘蓬勃【关键词】三氧化二砷［摘要］目的：应用cDNA芯片技术研究三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的作用。方法：采用包含4096个人类基因的cDNA表达谱芯片，检测三氧化二砷作用于RPMI8226细胞24h前后其基因表达的变化。结果：在mRNA水平上，273个基因的表达发生了明显改变，其中121个基因表达上调，152个基因表达下调。结论：三氧化二砷可引起RPMI8226细胞株一系列基因表达的改变。ZFYVE16、TXNIP及ALK1基因可能与RPMI8226细胞的分化与凋亡密切

2、相关。　　［关键词］三氧化二砷;DNA微阵列;多发性骨髓瘤　　ChangesofgeneexpressionprofileofmultiplemyelomacelllineRPMI8226treatedbyarsenictrioxide　　ABSTRACTObjective:ToparethechangesofgeneexpressionprofilesofmultiplemyelomacelllineRPMI8226beforeandafter24hourinterventionofarsenictrioxide.Methods:TheresponsesoftheRPM

3、I8226cellstoarsenictrioxideinedicroarrayangenes.Results:Ofthese4096genes,theexpressionsof273genesRNAlevel.Theexpressionsof121genesberofgenes.ZFYVE16,ALK1andTXNIPgenesmayplayimportantrolesinapoptosisanddifferentiationofRPMI8226cells.　　KEYM）是一种浆细胞恶性增殖性疾病。由于MM瘤细胞的增殖比例很低及多药耐药的形成，目前临床治疗该病仍十分困难

4、，迄今为止尚无根治的方法。最近的临床资料显示，三氧化二砷对MM有一定的治疗效果，且无严重的毒副作用［1,2］。为探寻三氧化二砷治疗MM的作用机制，本实验应用DNA微阵列技术研究三氧化二砷作用于MM细胞株后对其基因网络的调控作用。　　1材料与方法　　1.1材料（1）三氧化二砷，购自中国药品公司，样品溶于RPMI1640培养基（美国Gibco公司产品），灭菌分装备用，存储浓度为35mg/L，使用时稀释为工作浓度2μmol/L。（2）RPMI8226细胞，为人类MM细胞株，由西安交通大学第一医院血液中心提供。　　1.2细胞培养取RPMI8226细胞按1×105/ml浓度分别接种

5、于含及不含2μmol/L三氧化二砷的新鲜RPMI1640培养基中（内含10%小牛血清、1mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素），于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后收集细胞。　　1.3总RNA的提取按照TRIzolReagent（美国Gibco公司产品）说明书进行操作，提取RPMI8226细胞总RNA，采用OligotexmRNAMidiKit（荷兰QIAGEN公司产品）纯化mRNA，应用RNA电泳及分光光度仪测定光密度（opticdensity,OD）值，计算OD260/OD280值以鉴定mRNA质量。　　1.4探针

6、标记按美国Biostar公司芯片杂交试剂盒说明书操作。分别等量混合未使用三氧化二砷干预的RPMI8226细胞总RNA及已使用三氧化二砷干预24h后的RPMI8226细胞总RNA，各提取50μg逆转录合成cDNA。采用荧光染料Cy3dCTP标记未使用三氧化二砷干预的RPMI8226细胞cDNA，Cy5dCTP标记已使用三氧化二砷干预24h后的RPMI8226细胞cDNA，S200纯化柱纯化cDNA。　　1.5DNA微阵列制备DNA微阵列包含4096个基因cDNA（上海博星基因芯片有限公司提供，型号BiostarH40s），包括癌基因、抑癌基因、细胞信号转导基因、凋亡相关基因

7、及阴性对照等。采用通用引物进行多聚酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增。使用美国Cartesian公司的Cartesian点样仪及美国Telechem公司的硅烷化玻片进行点样。玻片经水合、干燥、紫外线交联后，分别采用2g/L十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）、水和2g/L硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。　　1.6杂交及洗涤DNA微阵列在95℃水浴中变性2min，混合探针在95℃水浴中变性30s，将混合探针加于DNA微阵列上，42℃杂交16～18h，按顺序使