梯度降解软骨支架材料应力刺激下与骨髓基质干细胞复合三维培养的实验研究

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1、梯度降解软骨支架材料应力刺激下与骨髓基质干细胞复合三维培养的实验研究作者：曲彦隆，杨卫良，孟祥文，王毅【关键词】基质干细胞　　摘要：　　［目的］探讨梯度降解软骨支架材料(GDABM)的细胞生物相容性及诱导后的骨髓基质干细胞(MSCs)在三维支架上培养的生物学行为。［方法］将MSCs与复合转化生长因子-β(TGFβ)的胶原共同混合后培养于三维软骨支架材料上，离心管内培养，10次／d，以600r／min离心10min。8h、24h、72h、4d、7d进行倒置显微镜形态学观察、扫描电镜观察。1～8d采用MTT法检测细胞增殖活性，描绘生长曲线。通过3HProline掺入实验了解材料对MSCs胶原

2、合成的影响。［结果］8h后MSCs在支架材料上呈球型黏附生长，4d后MSCs在支架材料上呈菱形或多角型复层生长，包裹于大量细胞外基质内。GDABM组细胞第3d进入对数增长期，倍增时间为475d，而单纯软骨细胞培养对照组倍增时间为525d。GDABM组与单纯软骨细胞培养对照组比较胶原合成略低，３HProline掺入值有显著性差异(P<005)，说明经诱导MSCs的细胞胶原分泌功能仍低于软骨细胞。［结论］经TGFβ诱导和低转速离心应力刺激后的MSCs向软骨细胞功能分化，复合细胞因子梯度降解软骨支架材料具有良好的生物相容性，可作为MSCs的有效载体应用于组织工程化软骨的构建。　　关键词：

3、基质干细胞；生物材料；生物相容性；组织工程　　　Abstract：［Objective］Tostudythebiopatibilityofgradientdegradationcartilagebiomaterials(GDABM)andbiologicalbehaviorofculturedmarroacell(MSCs)binedensionscaffoldintissueengineering.［Method］MSCs(5×106)in,10times/d,10minpertime.Themorphologicalcharacters,cellproliferationultian

4、gularlikemannerCellsinGDABMgroupreachedlogarithmincreasingperiodatthethirdday.Its'doublingtimeisingextracellularmatrixscaffoldforcelltransplantationincartilagetissueengineering.　　Keyacell;Biomaterials;Biopatibility;Tissueengineering　　软骨损伤退变造成的缺损修复仍是临床难题。国内外学者曾尝试同种异体或自体软骨移植等方法修复缺损，但存在排斥反应和供区功能缺失的问

5、题。组织工程的兴起为软骨损伤的修复提供了全新的思路和方法［1］。作者选择梯度降解软骨支架材料(gradientdegradationcartilagebiomaterials，GDABM)与骨髓基质干细胞体外培养，研究软骨支架材料的生物相容性、MSCs在三维支架材料上的生物学行为。　　1材料与方法　　11材料　　梯度降解软骨支架材料采用医用可吸收高分子聚合物：聚酯聚二氧杂环已烷(polydioxanone，PDS)、聚已酸内酯(polycarpolaction，PCL)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(polyDLlactidecoglcoliide85／15,PLGA)，PCL∶PDS∶PL

6、GA=1∶1∶1。聚合物纤维制成无纺布，纤维间距80μm。各组份梯度降解高峰时间：PDS4周，PLGA8周，PCL12周。包装后γ射线消毒备用。　　12方法　　121MSCs的分离培养　　新西兰幼兔，雌雄不限，无菌条件下截取双下肢长骨，剪除长骨干骺端，注射器吸取DMEM／F12培养液(Sigma，1∶1)冲洗骨髓腔，获取骨髓液，加等量淋巴细胞分离液梯度离心(2500r／min，15min)，吸取富含粒细胞层，即MSCs层，含10％胎牛血清DMEM／F12培养液中培养，原代细胞贴壁、融合成单层细胞后传代培养。　　122软骨细胞的分离培养　　取新西兰幼兔肋软骨剪切成碎块，02％胰蛋白酶30m

7、in,02％Ⅱ型胶原酶消化液60min依次消化。含10％胎牛血清DMEM／F12培养液培养，加入胶原及TGFβ(10ng／ml)后原代培养作为对照组。　　123MSCs与支架材料复合培养　　在胶原中加入TGFβ(10ng／ml)后与MSCs混合，调节接种密度为5×10６个细胞／ml，与支架材料在离心培养管中复合培养，8h后给予离心应力(600r／min，离心10min)刺激，10次／d。　　13观察及检测　　131倒置相差显微镜观察