一种用于生物芯片标记效率的研究方法

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1、一种用于生物芯片标记效率的研究方法作者：王治伟，马文丽，夏巍，杨琼，郑文岭【摘要】目的利用自杂交的方法对芯片杂交样品的标记效率进行检测和实验质控。方法提取人红白血病K562细胞RNA后，将核酸样品等分成两等份，分别应用通用引物标记Cy3和Cy5荧光物质，然后和制备的K562芯片进行杂交，通过比较杂交后探针上Cy3和Cy5的荧光信号强度，对样品的标记效率和杂交流程进行实验分析和质控。结果杂交后的芯片探针显示为等量的Cy3和Cy5重叠后的黄色荧光，由于样品是等量的同一种核酸物质，从而证明了样品标记的效率一

2、致性较好。结论通过自身杂交方法来比较相同样品两种荧光标记物的信号强度，对芯片本身的质量进行检测，分析标记物的标记效率，可以应用于生物芯片实验的质量控制。【关键词】生物芯片;标记;杂交　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofselfhybridizationmethodofanalyzingsampleslabelingformicroarrayexperiment.MethodsThetotalRNAsK562cellstosynthesizedoub

3、lestrandedcDNAsbyreversetranscription.Thentologoussamplesplesinedicroarray.ResultsTGAPS表面氨基化玻片购自Corning公司；DMSO及Formamide购自Amresco公司。　　1．2细胞培养K562细胞常规培养（37℃，5%CO2）于含10%（φ）的精制小牛血清和青霉素、链霉素各100u/mL的RPMI1640培养基中。　　1.3靶基因片段的制备应用RDPCR技术构建K562细胞正常状态下的cDNA片段

4、文库［4］，从中选择克隆扩增。PCR产物经纯化后，紫外分光光度计DU530测定浓度，用DMSO调整浓度为0.5mg/mL，加样至384孔板中备用。　　1.4芯片的制备　　一种用于生物芯片标记效率的研究方法用CartesianPixsys5500基因芯片打印仪和CMTGAPS玻片进行点样，然后在BIORAD紫外交联仪下以150MJ的总能量进行交联固定，80℃干烤2h后备用。　　1.5杂交样品的制备　　1.5.1细胞总RNA的提取　　具体实验步骤参照试剂盒说明，分别提取2次培养细胞的总RNA。　　1.

5、5.2mRNA的纯化　　mRNA纯化采用PharmaciamRNA纯化试剂盒。取40μgRNA加入1mL的Elutionbuffer悬浮,Oligo（dT）Cellulose沉淀，室温混匀10min以上，16000r/min离心10s，弃上清液。先用Highsaltbuffer洗涤沉淀5次，再用LoLLoin离心10s，洗2次。用0.2mL65℃预热的Elutionbuffer洗脱2次，收集2次流出液，DU530紫外分光光度仪进行定量。　　1.5.3Cy3、Cy5标记通用引物限制性扩增　　将纯化的m

6、RNA逆转录生成cDNA第一链后，继以RnaseH切割杂化双链中的mRNA，并作为合成cDNA第二链的引物延伸成双链cDNA，用Sau3AⅠ酶切，酶切片段加接头［SIP（5′pGATCmCACACCAGCCAAACCCA3′）和SIR（5′GGTTTGGCTGGTGTG3′）逐渐降温退火合成通用接头。取等同两份样品，加入25μL2×PCR缓冲液、5μLdNTP、1μL模板，2μLCy3以及Cy5荧光标记的通用引物（GTTTGGCTGGTGTGGATCU），加ddH2O至体积为49μL，最后加入1μLT

7、aqDNA聚合酶。95℃变性5min后，进行RDPCR扩增，18个循环（95℃30s、60℃30s、72℃60s），最后72℃延伸7min。取加接头的酶切片段1μL做模板，使用不标记荧光通用引物2μL，25μL10×PCR缓冲液，5μLdNTP（各2mmol/L），1.5μLCy5dUTP(1mmol/L)，加ddH2O至体积为49μL，最后加入1μLTaqDNA聚合酶，PCR反应条件同上。　　1.6杂交及检测　　打印好的芯片UItraGAPSTM片基置于含有预杂交液（25%甲酰胺，5×SSC，0

8、.1%SDS，0.5%BSA）42℃水浴5min，取15μL标记样品干燥离心，再用5μLddH2O溶解，95℃5min，冷却1min，加10μL杂交缓冲液（50%甲酰胺，10×SSC，0.2%SDS）。吸取3μL滴加到芯片阵列表面，置于Corning封闭杂交盒中42℃水浴16h。杂交后芯片转移到清洗液中（0.1×SSC，0.1%SDS）室温下清洗10min，0.1×SSC清洗5min，用100%酒精脱水干燥。用GSILumonics公司的ScanArra