胰腺癌组织中braf表达的初步研究

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1、胰腺癌组织中BRAF表达的初步研究作者：程张军,石欣,卫文俊,汤永辉,高乃荣[摘要]目的：了解BRAF基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平。方法：6例胰腺癌标本取自胰腺癌手术患者，3例正常胰腺组织取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。用Trizol法抽提每份组织的总RNA，分别进行紫外分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳及Labonchip检测，对总RNA进行质控；应用实时定量PCR技术检测正常胰腺和胰腺癌组织BRAF的mRNA水平；应用分期标准，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期2例、Ⅳ期2例。正常胰腺组织3例(N1～N3)，取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。手术切除后立即切取标本，

2、快速液氮冷冻，-80℃保存。1.2主要试剂和仪器TrizolRNA提取试剂盒（Sangon公司），逆转录酶SuperscriptⅡ（Invitrogen公司），SybrGreenⅠ（Invitrogen公司），InvitrogenRTPCR试剂盒（Invitrogen公司），QIAGENRNeasyKit（QIAGEN公司），Agilent2100Bioanalyzer（Agilent公司），兔抗人BRAF多克隆抗体sc166（SantaCruz公司），羊抗兔抗体（AmershamBiosciences公司）。1.3总RNA抽提用Trizol法按操作说明抽提每份正常胰腺及胰腺

3、癌组织总RNA。采用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理，以提高RNA纯度，并使用QIAGENRNeasyKit进一步纯化总RNA，操作方法按说明进行。分光光度计测定总RNA的纯度，琼脂糖凝胶电泳初步评价总RNA质量，用Agilent2100分析仪通过Labonchip进一步判定RNA样品的完整性。不符合质量标准的总RNA弃用，并重新抽提。　1.4实时定量PCR应用Primerpremier5.0软件，参照BRAF基因序列设计引物，上游引物为5′GGCAGAGTGCCTCAAAAAGAA3′，下游引物为5′AACCAGCCCGATTCAAGGA3′，βactin被用作管家基因，上游引物

4、为5′GCAGAAGGAAATCACAGCCCT3′，下游引物为5′GCTGATCCACATCTGCTGGAA3′，由上海博亚公司合成。每份标本取5μg总RNA，在逆转录酶SuperscriptⅡ（Invitrogen公司）作用下合成cDNA，加入引物1μl、荧光染料SybrGreenⅠ0.5μl，总反应体积25μl，按InvitrogenRTPCRkit操作说明进行PCR扩增，反应条件：50℃孵育2min，95℃10min，接着进行45个循环，95℃15s，59℃1min。定量方法采用比较Ct法。1.5g组织经研磨粉碎，加入1000μl新鲜配制的、冷的蛋白裂解液[50mmo

5、l・L-1TrisHCl,pH7.5,150mmol・L-1NaCl,2mmol・L-1EDTA,质量分数为1%的十二烷基磺酸钠(SDS)，每10ml加入1片蛋白酶抑制剂]，充分裂解后裂解液经4℃、14000r・min-1离心10min，取上清液并测定蛋白浓度。取40μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5min，置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移到PVDF膜，用1％BSA封闭。稀释度1∶1000的sc166于4℃过夜，加入相应的二抗室温下孵育60min，抗体检查按试剂盒说明书进行。应用GeneSnap软件（GeneGen

6、omeBioimaging,Syngene公司）进行定量分析。2结果2.1总RNA抽提及质量鉴定结果总RNA的OD260/OD280之值在1.8～2.0之间。琼脂糖凝胶电泳，18s和28s电泳条带清晰，28s和18s亮度之比≥2（图1）。Labonchip检测分析，18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现（图2），说明总RNA纯度高、无降解、质量好。正常胰腺组织胰腺癌组织2.2正常胰腺和胰腺癌组织BRAFmRNA表达水平PCR产物的定量方法采用比较Ct法，即先通过一系列的参数设定分析，得到不同样本相对于待测基因的Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的

7、荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数），再根据每个样品的参照基因将目的基因归一化，得到ΔCt=Ct待测基因－Ct管家基因，再转换为起始模板量I=2ΔCt。根据以上计算方法获得BRAF基因的起始模板量，从而反映出该基因在不同样本中的表达水平[2]。BRAF基因平均模板量(M)在正常组织中为0.0010167±0.00025，胰腺癌组织中为0.0026062±0.00109（表1、图3），与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中BRAF基因表达上调2.56倍。图3正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达注：I为起