新型增殖性腺病毒治疗肝癌的实验研究

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1、新型增殖性腺病毒治疗肝癌的实验研究【摘要】目的构建携带p53基因增殖性腺病毒HK600-p53载体，研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53。方法实验分为两组，单用HK600-p53组和单用Ad-p53组；采用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyltetrazoliumassay，MTT），观察两组对肝癌细胞株的杀伤效应。结果单用HK600-p53组较单用Ad-p53组肝癌细胞株细胞抑制率高；但当细胞抑制率达到80%以上时，两组之间差异无显著性，统计分析采用率的U检验。结论较Ad-p53相比携带p53基因的HK600-p53能更有效抑制肝癌细胞株，HK600-p53可望

2、成为肝癌基因治疗的新方法。　　【关键词】基因；p53；肝肿瘤；基因疗法　　Theeffectofneentofhepatocarcinomacellline　　【Abstract】ObjectiveToconstructareplicatingadenovirusvectorHK600-p53orgenep53,theninvestigateitsinhibitioneffectisbetterthanAd-p53onhepatocarcinomacellline.MethodsThesubjectisdividedintotethylthiazolyltetrazoliumassa

3、y（MTT）methodacellline.ResultsThesingleHK600-p53group’sinhibitionrateishigherthansingleAd-p53group;Butoreeffectiveininhibitiontohepatocarcinomacellline.HK600-p53maybeanneethodforhepatocarcinoma.　　【Keya;genetherapy　　p53基因是重要的肿瘤抑制基因，与肿瘤的发生、发展以及预后关系密切。已证明超过50%以上的肿瘤存在p53基因的异常，且发现p53基因的突变可能与肿瘤的耐药性密切相

4、关［1］，因而p53基因导入成为重要的肿瘤基因治疗手段，也可能是解决肿瘤耐药性的方法之一。本实验构建携带p53基因增殖性腺病毒HK600-p53载体，研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53。　　1材料与方法　　1.1材料293细胞、腺病毒载体pUC19购自加拿大MICROBIXBIOSYSTEMS公司；腺病毒载体pClon17、腺病毒载体HK600、腺病毒载体ppE3本室构建；限制性内切酶、胎牛血清、DMEM和Lipofectamine2000试剂盒购自Gibco公司；Taq酶、pfu酶购自MBI公司；T4DNA连接酶购自PROMEGA公司；琼脂糖、溴化乙锭购自GENE公司；

5、胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒DNA制备试剂盒和病毒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；人肝癌细胞株BEL-7402、人肝癌细胞株QGY-7703购自中国科学院上海细胞生物学研究所，人肝癌细胞株PLC/PRF5、人肝癌细胞株HepG2购自美国ATCC公司；增殖缺陷型腺病毒Ad-p53购自深圳赛百诺公司。　　1.2增殖性腺病毒载体HK600-p53构建设计引物，上游引物：5′-CCGGAATTCGCCATGGAGGAGCCGCAGT-3′；下游引物：5′-CGCGGATCCTTATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG-3′，PCR方法扩增p53基因，用胶回收试剂盒回

6、收大小为1179bp的DNA片段，回收片段及pUC19载体分别用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，将酶切后的p53目的基因片段与酶切后的pUC19载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取生长的细菌单克隆，PCR法筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定并测序（TaKaRa）正确后命名为pUC19-p53，将pUC19-p53用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，pClon17载体用EcoRⅠ和NheⅠ酶切，将酶切后p53目的基因片段与酶切后的pClon17载体连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，挑取生长的细菌单克隆，PCR法筛选阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒DNA，PCR及酶切鉴定，鉴定

7、正确后命名为pClon17-p53，将pClon17-p53用AgeⅠ、NotⅠ和ScaⅠ酶切，HK600用AgeⅠ、NotⅠ酶切，37℃水浴4h，分别电泳切胶回收2.469kb和10.35kb的片段，将酶切后含CMV启动子+p53基因+SV40poly-A加尾信号的目的片段与酶切后的HK600载体连接，转化、挑克隆、抽提质粒，PCR及酶切鉴定。　　1.3增殖性腺病毒HK600-p53的包装及鉴定利用Lipofectamine2000试剂盒，将质粒HK60