纳米银胶标记的dna电化学传感器制备及应用

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1、纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用【摘要】目的:研究一种新型的纳米银胶标记DNA电化学传感器的制备及应用。方法:通过将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成银胶DNA电化学探针。利用阳极溶出伏安法检测标记于DNA末端的Ag+，实现对特定序列DNA的测定。结果:经过实验条件的优化，测定DNA浓度在1.0×10-9～6.0×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为5.0×10-10mol/L。结论:该DNA电化学传感器响应快速、灵敏度高、稳定性好，适合于生物分析。【关键词】纳米银胶；电化学DNA传感器；杂交检测；阳极溶出法生物样品中特定DN

2、A序列的测定在生物医学领域具有重要意义[1]，其结果可用于对遗传性和传染性疾病进行鉴别和检测。在众多的杂交检测方法中，放射性同位素标记法存在着放射性污染等弊端，而非放射性标记法如荧光、化学发光和生物素标记方法的检测仪器昂贵，难以实现自动化，且标记过程繁琐复杂[2]。DNA电化学传感器因具有简便快速、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响等优点，已逐渐成为分子生物学研究中直接进行DNA序列检测的方法之一[3，4]。银胶是一种纳米材料，银胶粒子粒径小，比表面积大，表面反应活性高，从而具有良好的催化活性[5，6]。本研究将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成了高灵

3、敏度、高选择性DNA电化学传感器，实现了对特定序列DNA的检测。1材料和方法1.1仪器和试剂CHI650B电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司生产），原子力显微镜（NanoscopeⅢa，DigitaoInstruments,Inc.SantaBarbara.CA），紫外-可见分光光度计（Varian，美国）。人工合成的24个碱基的寡聚核苷酸片段(上海生工生物工程公司提供)：探针序列：5'-HS-(CH2)6-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3'(SH-ssDNA)互补靶序列：5'-TCGACCTGAAATGTTGCGCCGCTC-3'(ssDNA)非互补序列：5

4、'-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3'(ncDNA)硝酸银、吡咯溶液（分析纯，上海化学试剂公司生产），硼氢化钠（分析纯，Fluka公司生产），0.1mol/LNaCl和10mmol/L磷酸盐的混合液（pH=7.0）为缓冲溶液。制备银溶胶用去离子水（Millipore18MΩ），其余用水均采用二次蒸馏水。1.2纳米银胶的制备制备银溶胶所用的玻璃器皿均经铬酸洗液浸洗，最后用去离子水（Millipore18MΩ）荡洗几次。银溶胶的制备方法参见2结果和讨论2.1银胶标记DNA探针的性质银胶和银胶标记DNA探针的紫外-可见吸收曲线测定结果表明，两者在390nm处都有一个

5、最大吸收峰，而银胶标记DNA探针在256nm处多出现了一个DNA的特征吸收峰。通过比较可知，DNA通过巯基与银胶发生了作用，说明银胶已经标记在SH-ssDNA的末端。2.2阳极溶出伏安法(ASV)对Ag+的检测ASV法在微量金属离子的检测中显示了很大的优越性。一般来说，ASV法是指首先控制工作电极在某一适当的负电位值，使被测金属离子在电极上还原析出，然后反向扫描，使电极电位向正方向移动，于是被测离子溶解回到试液中，记录溶出过程中的电流-电位曲线，从而进行定量分析。杂交反应后，银胶标记DNA探针的量可以通过检测银的电化学信号来确定。因此，对特定序列DNA的检测就转化为对溶解在HNO

6、3中的Ag+的ASV法测定。图1为玻碳电极在0.01mol/LHNO3-KNO3底液中，测定1mmol/LAgNO3标准溶液的阳极溶出伏安曲线。从图中可知在+0.34V处有一溶出峰，它是富集在电极表面银从Ag0-Ag+的特征氧化峰。2.3电解富集电位和时间的影响ASV法有一个对被测物质进行预富集的过程，大大提高了检测的灵敏度。其中电解富集的电位和时间是影响灵敏度的两大要素。实验结果表明，当固定电解富集时间为3min时，随着富集电位从-0.1V向-0.5V变化时，得到的银溶出峰电流不断增大，这是由于单位时间内在电极上析出的物质的量增多所致。当电位进一步负移时，溶出峰电流不再增大，达

7、到了极限值。因此-0.5V被选为最佳富集电位。同时我们固定电解富集电位为-0.5V，发现银的溶出峰电流随富集时间的增长而增大。实验中，我们选择了3min作为还原富集时间。2.4杂交温度和杂交时间的影响在杂交过程中，温度的变化直接影响着反应的程度，当杂交温度过低时，溶液中的目标DNA扩散缓慢，从而影响了互补链碱基之间的配对；但是温度过高又会使DNA变性，影响杂交的程度。在本实验中当温度在35℃以下时，几乎没有杂交反应。温度在35～40℃的范围内时，杂交信号增加；当温度高于40℃后，