纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用

《纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用【摘要】目的:研究一种新型的纳米银胶标记DNA电化学传感器的制备及应用。方法:通过将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成银胶DNA电化学探针。利用阳极溶出伏安法检测标记于DNA末端的Ag+，实现对特定序列DNA的测定。结果:经过实验条件的优化，测定DNA浓度在×10-9～×10-mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为×10-10mol/L。结论:该DNA电化学传感器响应快速、灵敏度高、稳定性好，适合于生物分析。【关键词】纳米银胶；电化学DNA传感器；杂交检测；阳极溶出法生物样品中特定DNA序列的测定在生物医学领域

2、具有重要意义[1]，其结果可用于对遗传性和传染性疾病进行鉴别和检测。在众多的杂交检测方法中，放射性同位素标记法存在着放射性污染等弊端，而非放射性标记法如荧光、化学发光和生物素标记方法的检测仪器昂贵，难以实现自动化，且标记过程繁琐复杂[2]。DNA电化学传感器因具有简便快速、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响等优点，已逐渐成为分子生物学研究中直接进行DNA序列检测的方法之一[3，4]。银胶是一种纳米材料，银胶粒子粒径小，比表面积大，表面反应活性高，从而具有良好的催化活性[5，6]。本研究将纳米银胶标记于人工合成的5'端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成了高灵敏度、高选择性DNA电化学传感器

3、，实现了对特定序列DNA的检测。1材料和方法仪器和试剂CHI650B电化学分析仪，原子力显微镜，紫外-可见分光光度计。人工合成的24个碱基的寡聚核苷酸片段(上海生工生物工程公司提供)：探针序列：5'-HS-(CH2)6-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3'(SH-ssDNA)互补靶序列：5'-TCGACCTGAAATGTTGCGCCGCTC-3'(ssDNA)非互补序列：5'-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3'(ncDNA)硝酸银、吡咯溶液，硼氢化钠，mol/LNaCl和10mmol/L磷酸盐的混合液为缓冲溶液。制备银溶胶用去离子水，其余用水均采用

4、二次蒸馏水。纳米银胶的制备制备银溶胶所用的玻璃器皿均经铬酸洗液浸洗，最后用去离子水荡洗几次。银溶胶的制备方法参见文献[5]，即将30ml×10-mol/LNaBH4溶液置于冰浴中，在剧烈搅拌下，分批滴加入10ml×10mol/LAgNO3溶液，继续搅拌1/h，制得的溶胶呈黄色透明状，在℃下可稳定保存约1个月。用原子力显微镜对银溶胶粒子的形状和大小进行了表征，结果显示银溶胶粒子呈球状，均匀地分布在溶胶中，其纳米银粒子的尺寸在8～1nm之间。纳米银胶标记DNA探针的制备将探针序列SH-ssDNA溶解在新制备的银胶溶液中，SH-ssDNA的浓度为×10-mo1/L，室温下静置20h，使SH-

5、ssDNA与纳米银胶颗粒充分发生自组作用。然后将该溶液在1000r/min下高速离心30min，除去上层清液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀，再离心分离，以除去未反应的过量寡聚核苷酸，所得的探针用磷酸盐缓冲溶液稀释成一定的浓度，于0～℃保存，备用。待测DNA在玻碳电极上的固定参照文献[7]，将玻碳电极用Al2O3粉末在麂皮上打磨至光亮，并依次在丙酮、1:1NaOH溶液、1:1硝酸溶液以及二次蒸馏水中超声清洗。采用三电极体系，把电极插入含有mo1/LKCl和/L吡咯溶液中，以50mV/s的速度在0～+的电位范围内循环伏安扫描15圈后，在电极表面形成一层均匀的薄膜，吡咯被电化学聚合到电极表面。取

6、出电极，把它浸入到待测DNA溶液中，在+恒电位下吸附200s，通过静电作用，DNA被固定在聚吡咯修饰的玻碳电极表面。电极用KCl溶液冲洗后以除去多余的未固定的DNA。杂交反应将固定了不同单链DNA片段的玻碳电极同时浸入到依据上述制得的纳米银胶标记DNA探针溶液中进行杂交反应，40℃下均匀搅拌1h。取出后，清洗除去表面吸附的未杂交的纳米银胶标记探针。银的氧化溶解及测定将杂交后结合了纳米银胶的玻碳电极浸入50%的HNO3溶液中，振荡使银氧化溶解，等黄色的纳米银胶逐渐变成无色的溶液时，表明胶体中的Ag原子已经被HNO3氧化成Ag+。取出电极后加入/LHNO3-KNO3溶液作为支持电解质底液，

7、以铂丝为对电极，氯化银电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，采用阳极溶出伏安法对Ag+进行电化学检测。结果和讨论.1银胶标记DNA探针的性质银胶和银胶标记DNA探针的紫外-可见吸收曲线测定结果表明，两者在390nm处都有一个最大吸收峰，而银胶标记DNA探针在25nm处多出现了一个DNA的特征吸收峰。通过比较可知，DNA通过巯基与银胶发生了作用，说明银胶已经标记在SH-ssDNA的末端。.2阳极溶出伏安法(ASV)对Ag+的检测ASV法在微量金属离