免疫组化方法研究女性胎儿尿道括约肌的神经支配

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1、免疫组化方法研究女性胎儿尿道括约肌的神经支配作者：杨荣辰　周荣祥　王鹏　陈强【摘要】　　目的探讨支配女性尿道括约肌神经纤维的定位、定量及定性。方法12例21周至40周的女性胎儿尿道，分别进行石蜡包埋、胆碱乙酰基转移酶(cholineacetylcatransferase,CHAT)及神经肽Y(neuropeptideY,NPY)免疫组化染色，并对其结果进行半定量和定量分析。结果从尿道内口至外口，神经肽Y阳性区域显色范围逐渐变小、强度减弱，胆碱乙酰基转移酶阳性区域主要位于尿道中三分之一，统计学上具有显著性差异。结论尿道括约肌的胆碱乙酰基转移酶及

2、神经肽Y免疫组化染色对理解参与控尿的尿道括约肌神经支配提供了很有价值的帮助。【关键词】控尿　神经支配　尿道括约肌　免疫组织化学　　Innervationofthefemalehumanfetusurethralsphincterbyimmunohistochemicalstudies　　ABSTRACT:ObjectiveToexplorethelocation,quantityandnatureofnervefibersinnervatingtheurethralsphincter.MethodsUrethraof12femalehuman

3、fetusesbetbeddedmunohistochemicalstaining.Thestainingresultsiquantitatively.ResultsFromtheurethrainternalorificetoexternalorifice,thepositiveregionofNPYbecamesmallerandthedensitythinner;thepositiveregionofCHATainlylocatedinthemiddlepartofarethra,andthere.ConclusionTheimmuno

4、histochemicalstainingofcholineacetylcatransferaseandneuropeptideYintheanatomicalstructuresoftheurethralsphincterprovidesabetterunderstandingoftheoriginandnatureoftheinnervationparticipatinginurinarycontinence.　　KEYmunohistochemitry　　女性尿道括约肌的内在机制是由平滑肌和横纹肌成分组成，它们各自接受相互独立的神经支配

5、，这些机制目前尚不十分清楚[1]。大多数学者认为女性尿道括约肌是由来自阴部神经(躯体神经)和盆丛(自主神经)的神经纤维共同支配[2]，但有关女性尿道括约肌及其支配神经精确的定位、定量及定性方面的研究在国内外报道较少。本实验采用免疫组织化学染色及显微图像分析技术，对国人正常女性胎儿尿道的胆碱能及肾上腺素能神经进行定位、定量研究，从而探讨它们在控尿方面的作用。　　1资料与方法　　1.1资料选取12个正常女性胎儿，21-40周胎龄。测其冠臀长度为165-340mm，胎儿死亡1h内完整取下尿道，尿道长度为9-15mm，另取成人新鲜大脑皮质及肾上腺髓质

6、标本做阳性对照，以上标本均经40g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋。　　我们应用12个21-40周胎龄的女性胎儿尿道，是因为胎儿在妊娠15周时横纹肌和平滑肌之间已显示出明显的区别[3]，这个阶段的胎儿能够在肉眼下解剖，括约肌的基本类型已经建立[4]。　　1.2试剂和仪器NPY多克隆抗体购自武汉博士德生物制药有限公司，CHAT多克隆抗体及ABC检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，Biogenexi6000全自动免疫组化染色系统由广州新捷仪器有限公司生产，Quantimet970型显微图像分析仪产自英国剑桥仪器公司。　　1.3方法　　1.3.1

7、制作切片将石蜡包埋的女性尿道标本从内口至外口做连续切片，片厚4μm，根据尿道长度平均分成8个截面，加之内、外口，每个截面各取2张切片，分别做CHAT和NPY染色。　　1.3.2免疫组化染色常规ABC法。切片脱蜡至80%(体积分数)乙醇，甲醇H2O2溶液中震荡10min，置于枸橼酸盐缓冲液中，微波炉加热12min，温度在96℃左右，取出后自然冷却(抗原修复)。一抗分别为多克隆抗CHAT抗体及多克隆抗NPY抗体，湿盒内孵育60min，二抗37℃30min，三抗37℃50min，DAB液显色约8min。以成人大脑皮质作CHAT的阳性对照，成人肾上

8、腺髓质作NPY的阳性对照，以TBS缓冲液代替一抗作阴性对照。一抗稀释度为1∶200。　　1.4观察指标采用半定量的方法根据免疫组化反应呈色深浅及反应颗粒多少，将酶活