类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究-

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1、类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究*作者：金岩1，黄懿1，成扬2，付海军3【摘要】对56例江浙沪地区类天疱疮患者的临床特征和不同靶抗原的关系进行了探讨，发现类天疱疮多发于老年人，并以大疱性多见；在BP的急性期抗体结合230kD、230/180kD、合并条带靶抗原较常出现(86.11%)；而在疾病的缓解期抗体结合180kD抗原较常出现(65%)；180kD靶抗原并非次要抗原。【关键词】类天疱疮；临床特征；靶抗原【Abstract】56casesofbullouspemphigoid(BP)munol-blo

2、tpatterns.Itphigoidhappenedmostlyamongoldpeopleinbulloustype；AutoantigenBP230，BP230/180andBP230/180binedinorantigensinvolvedinacutephaseofBPpatient；SF，Promega产品)；依地酸钠(EDTA，Sigma产品)；蛋白酶抑制剂(pepstatin，antipain，leupeptin，chymostotin，Sigma公司产品)；十二烷基硫酸钠(SDS，日本进口分

3、装)；高速低温离心机(HITACHI，日本进口)；751型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；热分离缓冲液；12.5mmolTRIS-HCl，pH6.8，100μlPMSF(热分离前加)；表皮提取液：2%SDS，65mmolTRIS-HCl，pH6.8，20mmolPMSF，10mmolEDTA，含四种蛋白酶抑制剂(热分离前加)。1.2.2方法(1)新鲜外科手术皮肤标本，用图钉固定在木板上，用手术刀除皮下脂肪组织，削真皮至0.5mm厚，冷生理盐水反复冲洗。(2)热分离缓冲液分两份，一份置37℃水浴，另一份置56

4、℃水浴，10min备用。(3)将皮肤剪成2cm×2cm大小，放入37℃热分离缓冲液20min，再迅速放入56℃热分离缓冲液中40s，取出冷却，用手术刀背轻轻分离表真皮。(4)表皮按25～30cm2比1ml的比例加入表皮提取液中，放入组织匀浆器内匀浆(匀浆器放冰中)。(5)匀浆液置塑料管中，于液氮中反复冻融3次，每次10min，后12000rpm离心，4℃，30min，取上清即为表皮提取液，-40℃保存。(6)751分光光度计测定表皮抗原提取液蛋白含量，在595nm处测OD值，参照标准蛋白(小牛血清白蛋白)，计

5、算样品中蛋白含量。1.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.3.1材料(1)表皮抗原提取液；(2)主要试剂及仪器丙烯酰胺(acrylamide，Fluka产品)；甲叉丙烯酰胺(N，N′-Methylenebis-acrylamide，Fluka产品)；四甲基已二胺(TEMED，Promega产品)；过硫酸胺(APS，华美公司产品)；次高分子量标准分子蛋白(上海生化所产品)；甘氨酸(Gly，上海试剂三厂，分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(TRIS，FARCO产品)；2-巯基乙醇(2-ME，Fluka产品)；垂直电泳槽(上海

6、精益有机玻璃制品厂)；稳流稳压电泳仪(丹阳无线电一厂)；聚丙烯酰胺母液(Acr-Bis，丙烯酰胺30g，甲叉丙烯酰胺0.8g，双蒸水加至100ml，磁力搅拌溶解，过滤，置棕色瓶4℃保存)；浓缩胶(Acr-bis0.6ml，0.5MpH6.81.25ml，双蒸水3.1ml，10%SDS0.05ml，10%APS0.025ml，TEMED5μl)；分离胶(Acr-Bis2.3ml，1.5MpH8.8Tris-HCl2.5ml，双蒸水5ml，10%SDS0.1ml，10%APS0.1ml，TEMED10μl)；电泳

7、缓冲浓缩液(Tris15g，Gly7.2g，SDS5g，双蒸水加至500ml，过滤，使用时1∶10稀释)；样品液(12mMTris-HCIpH6.8，含20%甘油，10%SDS，10%2-ME，溴酚蓝适量)。表皮提取液与样品液1∶1混合，用时煮沸；固定液(500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，400ml双蒸水)；脱色液(250ml无水乙醇，80ml冰醋酸，加双蒸水至1000ml)；染色液(考马斯亮兰0.29g，加250ml脱色液，棕色瓶4℃保存)。1.3.2方法1.3.2.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将干净的

8、长短玻璃板用橡皮圈套好，放入垂直电泳槽，螺母固定，底边缝隙用1%琼脂封闭，配制分离胶，轻倒入两玻璃板间空隙内，再加入少量含正丁醇双蒸水，将分离胶压平，静置，过夜，倒去水，配制浓缩胶，轻倒入分离胶上方空隙内，插入塑料梳，静置3h。轻取塑料梳，分别加入标准品和样品，两侧水槽内加入电泳缓冲液，100V，1h，再160V3～4h。1.3.2.2显色将电泳好的凝胶小心取出，放入固定液中，置摇床上摇动1h；再将