低氧反应元件调控缺血心肌转染hvegf165基因表达对新生血管的影响

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1、低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新生血管的影响：董红燕,王强，张中明,袁延亮，张宜乾，徐夏红【摘要】目的探讨动物整体水平下低氧反应元件(HRE)调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对促生血管的影响。方法建立兔心肌缺血动物模型，实验分为转基因组、缺血对照组、载体对照组和假手术组。取缺血区心肌组织，检测心肌组织HIF-1α和hVEGF165表达，应用CD31及α-SMA免疫组化染色测定缺血心肌新生血管密度变化。结果心肌缺血早期，伴随内源性HIF-1α表达增加，hVEGF165mRNA及蛋白表达相继升高，缺血4～6周至高峰(P<0.01)，缺血12周，hVEGF

2、165表达下调至缺血前水平。缺血12周，转基因组CD31（＋）血管密度显著高于缺血对照组(P<0.01)；但是，与缺血前相比，缺血12周，转基因组α-SMA（＋）血管密度显著低于缺血前水平(P<0.01)。结论HIF-1α-HRE对缺血心肌转染hVEGF165表达发挥了有效的正相调控作用，有效地促进缺血心肌毛细血管生成。但hVEGF165作为促血管生成早期调节因子，其促生血管的结构尚不完整。【关键词】低氧反应元件；血管内皮生长因子；基因调控;心肌细胞;缺氧本课题组前期研究结果表明，在细胞水平，低氧反应元件（HRE）对缺血心肌转染hVEGF165基因表达发挥了良好的调控作用［1

3、-2］。但是，在动物整体水平，HRE对缺血心肌转染hVEGF165基因长期调控行为对促血管再生的影响尚未阐明，本研究旨在动物整体水平，探讨在HRE调控下，缺血心肌转染hVEGF165基因表达对再生血管生成的影响，为提高缺血心脏hVEGF165基因治疗的有效性及安全性提供实验依据。　　1材料和方法　　1.1病毒包装及纯化　　pAAV-9H-hVEGF165由美国加利福尼亚大学Prof.Su惠赠。pAAV-Helper、pAAV-RC由北京协和医院提供。病毒包装由本课题组前期工作完成［1］。将HEK293T细胞接种于9cm平板，10μgpAAV-9H-hVEGF165、10μgpAAV-RC

4、、15μgpAAV-Helper、2.5mol/LCaCl2100μl与去离子水混合至500μl，加入500μl2HeBS，混匀后加入HEK293T细胞培养皿中，培养2～3天，将细胞从培养皿上刮下、离心，加入80mmol/LMgCl2的PBS至细胞密度为107个/ml，加入DNA酶Ⅰ和RNA酶,离心，取上清加入粉剂PEG8000至终浓度10%；冰上置1h，离心，25mol/LTris-HCl（pH8.0）溶解沉淀。采用等体积氯仿抽提，离心，回收水相，-20℃保存、备用。　　1.2实验动物　　成年新西兰大耳白兔，雌雄不限，体重2～2.5kg，平均（2.3±0.15）kg，共147只。由徐州

5、医学院实验动物中心提供。　　1.3实验方法　　1.3.1心肌缺血动物模型制备　　动物硫贲妥钠静脉麻醉，正中开胸，显露心脏。在左冠状动脉前降支上1/3交界处，6-0无损伤线缝扎，肉眼见结扎点下方左室前壁心肌渐变青紫、肿胀，同期监测ECG出现典型心肌缺血改变者，确认模型成功。　　1.3.2实验动物分组及处理　　实验动物随机分为4组。转基因组（A组，n=42）：模型动物，心脏缺血区域分4点注射40μlrAAV-9HRE-hVEGF165。缺血对照组（B组，n=42）：模型动物，心脏缺血区分4点注射40μl0.01mmol/LPBS。载体对照组（C组，n=42）：模型动物，心脏缺血区分4点注射4

6、0μl9HRE-LacZ。假手术组（D组，n=21）：正常动物，仅开胸，游离左冠状动脉，未结扎。4组动物分别于缺血前(0)及术后2、4、6、8、10、12周取材（A、B、C组每时间点6只，D组3只）。麻醉后取动物心脏，取材组织分别采用液氮保存（Realtime-RT-PCR及A）表达。石蜡切片，胰蛋白酶消化抗原修复。0.03%TritonX-100处理切片10min，PBS冲洗，5%正常羊血清封闭；分别加入一抗（小鼠抗兔CD31抗体，1∶50；小鼠抗兔α-SMA抗体，1∶50)，4℃过夜；加入羊抗小鼠二抗（1∶200），DAB显色。　　应用HMIAS2000型图像分析系统（武汉千屏影像公

7、司），观察CD31及α-SMA免疫组化染色阳性组织切片，以直径（短径）5～8μm血管为毛细血管、直径（短径）15～50μm血管为微动脉血管，进行图象分析，测定血管密度［3］。　　1.4统计学处理　　资料以±s表示，采用单因素方差分析及q检验进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1缺血心肌HIF-1α表达测定结果　　转基因组和缺血对照组缺血心肌均可见内源性HIF-1αmRNA表达，其表达呈先增后减趋势。缺血2