rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义

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1、Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义【摘要】目的：证实Rac1在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义，寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。方法：特异性抑制Rac1蛋白表达的siRNA干扰肝癌高转移细胞株97H，观察肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。结果：肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长受抑制，肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。结论：Rac1表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭，可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。【关键词】Rac1肝癌高转移细胞株s

2、iRNA移［Abstract］Objective:ToproveRac1mightplayanimportantroleintheproliferationandtransferenceofhepatomacell.Methods：smallinterferenceRNAtechniqueployedtoknockdoacellline97H.Results：TheproteinlevelofRac1,thecellproliferation,thecellvitalityandtheabilityto

3、invadethereconstitutedbasementmembraneaticallyaftertransfectionightplayanimportantroleinthedevelopment,progression,transferenceofhepatomaandalsoprovideapossiblestrategyfortheinterferenceoftumorangiogenesisbytargetingtheRac1.［Keyacell;siRNA;transference肝癌的

4、基因治疗正在不断探索中,表达调控治疗是肝癌基因治疗的重要策略。在先前的研究中我们发现肝癌细胞株Rac1的表达显著高于正常肝细胞株，提示Rac1与肝癌的生长和转移有密切的关系［1］。本次研究我们运用RNA干扰技术，调控信号分子的表达，进一步证实Rac1与肝癌生长转移的关系，为肝癌的基因治疗寻找新的靶点。1材料与方法1.1材料肝癌高转移细胞株97H由复旦大学附属中山医院肝癌研究所分离和保存。LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；兔抗人Rac1购自SantaCruz公司；鼠抗人

5、的βactin购自RD公司；HRP标记山羊抗鼠二抗，HRP标记山羊抗兔二抗购自Biochemicol公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海申能博彩公司；PVDF膜购自华舜公司；CostarTrans，直径6.5mm），购自Corning公司；TrigelBasementMembraneMatrix(356237,PhenolRedfree),购自BD公司；siRNA由上海化学基因公司合成。1.2研究方法肝癌高转移细胞株97H用含10%小牛血清的DMEM培养液置于37℃，5%CO2的培养箱

6、中培养。1.2.1siRNA合成在基因库中查到人Rac1基因序列（编号是NM_198829），输入到RNAi设计软件中，得到4个siRNA片段序列，选择特异性最好的三种加上文献报道的针对大鼠Rac1的一段序列，序列如下：1号siRNA：5′UGUCCGUGCAAAGUGGUAUtt3′5′AUACCACUUUGCACGGACAtt3′2号siRNA：5′UCCUAUCCGCAAACAGAUGtt3′5′CAUCUGUUUGCGGAUAGGAtt3′3号siRNA：5′CUUUGCAAAG

7、ACCUUCGUCtt3′5′GACGAAGGUCUUUGCAAAGtt3′4号siRNA：5′GUUCUUAAUUUGCUUUUCCtt3′5′GGAAAAGCAAAUUAAGAACtt3′上述siRNA由上海化学基因公司合成，分别为5nmol，另未知序列的对照siRNA也购自上海化学基因公司。5nmolsiRNA溶于250μl退火缓冲液中，分装后置于－70℃冰箱保存。1.2.2分组筛选正常对照组为c组，对照siRNA为0组，此次设计的分别为1，2，3组，文献报道的针对大鼠Rac1的siR

8、NA为4组。经中山医院钱成博士筛选，选定2号组作为本实验用siRNA。1.2.3LipofectamineTM2000介导的siRNA干扰将细胞接种于六孔板，生长至60%～80％融合，干扰前24小时，PBS洗涤两次，更换为不含抗生素的DMEM培养液1ml。再取30μl含siRNA的退火缓冲液加入470μlOptiMEMⅠ；另取一离心管，分别加入30μlLipofectamineTM2000和120μlOptiMEMⅠ室