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时间:2018-08-01
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1、Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义【摘要】目的:证实Rac1在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义,寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。方法:特异性抑制Rac1蛋白表达的siRNA干扰肝癌高转移细胞株97H,观察肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。结果:肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长受抑制,肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。结论:Rac1表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭,可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。【关键词】Rac1肝癌高转移细胞株siRNA移[Ab
2、stract]Objective:ToproveRac1mightplayanimportantroleintheproliferationandtransferenceofhepatomacell.Methods:smallinterferenceRNAtechniquewasemployedtoknockdowngeneexpressionofRac1inhepatomacellline97H.Results:TheproteinlevelofRac1,thecellproliferation,thecellvit
3、alityandtheabilitytoinvadethereconstitutedbasementmembraneweredecreaseddramaticallyaftertransfectionwithaRac1specificsiRNAvector.Conclusion:Rac1mightplayanimportantroleinthedevelopment,progression,transferenceofhepatomaandalsoprovideapossiblestrategyfortheinterf
4、erenceoftumor12angiogenesisbytargetingtheRac1.[Keywords]Rac1;hepatomacell;siRNA;transference肝癌的基因治疗正在不断探索中,表达调控治疗是肝癌基因治疗的重要策略。在先前的研究中我们发现肝癌细胞株Rac1的表达显著高于正常肝细胞株,提示Rac1与肝癌的生长和转移有密切的关系[1]。本次研究我们运用RNA干扰技术,调控信号分子的表达,进一步证实Rac1与肝癌生长转移的关系,为肝癌的基因治疗寻找新的靶点。1材料与方法1.1材料肝癌高转移细
5、胞株97H由复旦大学附属中山医院肝癌研究所分离和保存。LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;兔抗人Rac1购自SantaCruz公司;鼠抗人的βactin购自R&D公司;HRP标记山羊抗鼠二抗,HRP标记山羊抗兔二抗购自Biochemicol公司;细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海申能博彩公司;PVDF膜购自华舜公司;CostarTranswellTM培养板(3422,孔径8μm,直径6.5mm),购自Corning公司;TrigelBasementMembraneM
6、atrix(356237,PhenolRed12free),购自BD公司;siRNA由上海化学基因公司合成。1.2研究方法肝癌高转移细胞株97H用含10%小牛血清的DMEM培养液置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。1.2.1siRNA合成在基因库中查到人Rac1基因序列(编号是NM_198829),输入到RNAi设计软件中,得到4个siRNA片段序列,选择特异性最好的三种加上文献报道的针对大鼠Rac1的一段序列,序列如下:1号siRNA:5′UGUCCGUGCAAAGUGGUAUtt3′5′AUACCACUU
7、UGCACGGACAtt3′2号siRNA:5′UCCUAUCCGCAAACAGAUGtt3′5′CAUCUGUUUGCGGAUAGGAtt3′3号siRNA:5′CUUUGCAAAGACCUUCGUCtt3′125′GACGAAGGUCUUUGCAAAGtt3′4号siRNA:5′GUUCUUAAUUUGCUUUUCCtt3′5′GGAAAAGCAAAUUAAGAACtt3′上述siRNA由上海化学基因公司合成,分别为5nmol,另未知序列的对照siRNA也购自上海化学基因公司。5nmolsi
8、RNA溶于250μl退火缓冲液中,分装后置于-70℃冰箱保存。1.2.2分组筛选正常对照组为c组,对照siRNA为0组,此次设计的分别为1,2,3组,文献报道的针对大鼠Rac1的siRNA为4组。经中山医院钱成博士筛选,选定2号组作为本实验用siRNA。1.2.3LipofectamineTM2000介导的siRNA
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