il1β对成纤维细胞合成ⅰ型胶原蛋白作用及机制

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1、IL1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制：李学森褚言琛邹云雯王志杰【摘要】目的研究白细胞介素1β(IL1β)对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的作用及机制，以探讨IL1β对硬膜外瘢痕形成的影响。方法将NIH3T3细胞随机分为IL1β组、IL1β+SB202190(p38MAPK特异性阻断剂)组和对照组,各组经无血清培养20h后，IL1β组加入10μg/L的IL1β，IL1β+SB202190组用10μmol/L的SB202190预作用1h后加入10μg/L的IL1β，对照组直接加体积分数0.02的血清。各

2、组培养24h后收集细胞，采用RTPCR法检测Ⅰ型胶原α2基因(COL1A2)mRNA的表达，ethodsTheNIH3T3cellsfreeculturingfor20hours,10μg/LofIL1βol/L)for1hourbeforeaddingIL1β(10μg/L),andthecontrolgroupreceivedsamevolumeof2%serum.Afterculturingforanother24hours,cellsRNAandproteinexpressionsoftypeⅠcolla

3、genA2(COL1A2)detectedRNAandproteinexpressionsofCOL1A2inIL1βgroupRNAandproteininIL1β+SB202190groupightinhibittheformationofepiduralscarbyinhibitingtheexpressionofCOL1A2inNIH3T3cells,andp38signalingpathayplayanimportantroleintheprocessofscarformation.　　[KEYAPK信号通路

4、是目前丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路中的一个重要成员,参与细胞对许多外界刺激的调节反应[56]。本研究应用IL1β以及p38MAPK的特异性阻断剂(SB202190)作用NIH3T3细胞，从胶原基因的转录水平调控及蛋白水平调控来研究IL1β在纤维化过程中的作用及其机制，以期为硬膜外瘢痕的防治提供理论依据。现将结果报告如下。　　1材料与方法　　1.1实验试剂　　NIH3T3小鼠胚成纤维细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM高糖培养基和2.5g/L胰蛋白酶(Gibco公司)，小鼠IL1

5、β(PeproTech公司),p38MAPK特异性阻断剂SB202190(Sigma公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),以Ⅰ型胶原α2基因(COL1A2)兔多克隆抗体和βactin鼠单克隆抗体(SantaCruz公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(SantaCruzs公司)为二抗,TrizolRNA提取液和RTPCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司),小鼠COL1A2mRNA及内参照(GAPDH)的PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，化学发光剂(北京全式金生物技术

6、有限公司),4×上样缓冲液(Solarbio公司)。　　1.2实验分组与处理　　NIH3T3细胞在含体积分数0.10胎牛血清的DMEM高糖培养基中常规培养,选择对数生长期的NIH3T3细胞，用2.5g/L的胰酶消化成单细胞悬液，按约0.5×108/L的密度以均等的细胞数分别分装到3个25cm2培养瓶中，于37℃、体积分数0.05CO2培养箱中培养，待融合达70%～80%时,随机分为IL1β组、SB202190+IL1β组及对照组，各组经无血清DMEM培养20h后，更换培养液。IL1β组加入浓度10μg/L的IL1β

7、;IL1β+SB202190组用10μmol/L的SB202190预作用1h后更换培养液,加入浓度10μg/L的IL1β;对照组直接加含体积分数0.02胎牛血清的培养基。经上述换液后,继续培养24h，收集细胞。　　1.3检测指标及方法　　1.3.1COL1A2mRNA表达的检测应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法。细胞培养24h后，按照Trizol细胞裂解液说明提取细胞总RNA，所获样品总RNA的A260/A280比值为1.8～2.0。取2μg总RNA按照逆转录试剂盒说明书方法行逆转录反应,合成cDNA,随后进行

8、PCR扩增。引物设计应用Primier5.0软件，计算机完成。PCR引物序列:①小鼠COL1A2:上游引物5′CTCTGTCCTAGTCGATGGCTGC3′,下游引物5′ACGGAATTCTTGGTCAGCACC3′,扩增片段长为142bp;②GAPDH:上游引物5′GCATTGTGGAA