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1、影响鸡血细胞体外融合的各种因素分析 细胞融合,又称细胞杂交,是指在离体条件下人为地将不同种生物或者同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术.PEG法诱导细胞融合,细胞容易制备、活性稳定、不需要特制的仪器设备、操作方便、融合率较高,因而被广泛用于细胞遗传、细胞免疫、基因定位、病毒、肿瘤等基础研究,也用于单克隆抗体制备和生物新品种培育,同时也被作为大学细胞工程实验教学内容.在实际操作中,该方法易受许多因素的影响,如PEG浓度、PEG作用时间、鸡血细胞悬液浓度、鸡血细胞悬液放置时间、钙离子浓度等,致使有时融合率不高
2、或不稳定. 本研究以家鸡血红细胞为材料,探索影响细胞体外融合的各种因素,为动物细胞融合研究和细胞生物学相关实验提供参考. 1材料与方法 1.1实验材料及仪器 公鸡全血,PEG,NaCl,Hanks液,0.5%酚红,GKN液.血细胞计数板,刻度离心管,离心机,水浴锅,盖玻片,容量瓶,载玻片,移液管等. 1.2实验方法 1.2.10.85%NaCl溶液的配制称取NaCl0.85g,溶于100mL的蒸馏水中. 1.2.2GKN液的配制称取NaCl8.0g、葡萄糖2.0g、Na2HPO42H2O1.77g、KCl0.4g、N
3、aH2PO4H2O0.69g、酚红0.01g,溶于1000mL的重蒸水中. 1.2.3Hanks液的配制原液A:称取NaCl16.0g、KCl8.0g、MgSO47H2O2.0g、MgCl26H2O2.0g、CaCl2(无水)2.8g,溶于双蒸水至1000mL,滤纸过滤,储存于4.0℃;原液B:葡萄糖20.0g、Na2HPO412H2O0.06g、KH2PO41.2g、双蒸水800mL,用滤纸过滤,加入0.5%酚红80mL,加水至1000mL,储存于4.0℃. Hanks液:A、B液各1份,双蒸水18份,用5.6%NaHCO3
4、调节pH至7.4. 1.2.4不同浓度的PEG溶液(m/V)的配制(1)分别称取PEG6g置于4个小烧杯中,然后放入恒温水浴锅中水浴加热,使其融化. (2)让PEG缓慢冷却到50~60℃,注意不要使PEG凝固. (3)向4个小烧杯中分别加入预热至50℃的GKN液混匀,配制成10%,30%,50%,70%的PEG溶液. 1.2.5鸡血细胞悬液的配制 (1)用注射器在鸡翼下静脉采血,注入试管后,迅速加入肝素(20U肝素/mL全血),混合均匀,制成抗凝全血. (2)向抗凝全血的试管中加入4倍体积的0.85%的生理盐水溶液
5、.混合均匀,制成红细胞贮备液,4℃冰箱保存. (3)取1mL的鸡血细胞贮备液于刻度离心管中,加入4mL0.85%的生理盐水,混合均匀,放入低速离心机中,1000r/min条件下离心5min,弃上清.按上述条件再离心一次. (4)将沉淀物配制成悬浮液.并采用血球板计数法将悬浮液分别稀释成细胞密度为1106,1107,1108个/mL的悬液. 1.2.6细胞融合实验方法 (1)不同条件下细胞融合方法①不同鸡血细胞悬液浓度下细胞融合方法分别取1mL细胞密度为1106,1107,1108个/mL的鸡血细胞悬浮液(其中含有的Ca
6、Cl2浓度为12.6mmol/L)到3支刻度离心管,分别加入4mLHanks液后混匀,1000r/min条件下离心5min,弃上清,通过用手指多次轻弹离心管底部使沉淀的血细胞团块变得松散.向3支刻度离心管中分别加入0.5mL浓度为50%的PEG溶液(预热至37℃),要沿管壁缓慢加入,边加边摇匀,加入后在37℃水浴锅中静置10min.②不同PEG浓度下细胞融合方法按照①的操作方法进行,其中1mL鸡血细胞悬浮液的细胞密度固定为1107个/mL,加入浓度分别为10%,30%,50%,70%的PEG溶液.③不同PEG作用时间下细胞融合方法
7、按照②的操作方法进行,其中PEG溶液的浓度固定为50%,加入PEG溶液后静置时间分别为2,5,10,20min.④不同鸡血细胞悬液放置时间下细胞融合方法按照③的操作方法进行,其中加入PEG溶液后静置10min,1mL鸡血细胞悬浮液分别放置5,10,15min后再加入到离心管中.⑤不同钙离子浓度下细胞融合方法按照①的操作方法进行,其中1mL细胞密度为1107个/mL的鸡血细胞悬浮液中含有的钙离子浓度分别为0,12.6,50.0,75.0,100mmol/L. (2)终止PEG作用及染色观察①向各离心管中缓慢加入5mLHanks液,
8、然后轻轻吹打混匀,在37℃水浴锅中静置5min,终止PEG作用.②为使细胞团分散,多次用吸管轻轻吹打细胞团,1000r/min条件下离心5min,使细胞完全沉降,弃上清.然后按上述条件,再次离心,弃上清,加入少许Hanks液,混匀.③在上述各离心管
