epo在骨肉瘤中的表达及统计分析

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1、EPO在骨肉瘤中的表达及统计分析【摘要】目的：探讨EPO在骨肉瘤组织中的表达及意义。方法：收集武汉市四大三级甲医院的骨肉瘤20例及良性骨软骨瘤5例,将实验分为骨肉瘤组(n=20)和良性骨软骨瘤组(n=5),采用免疫组织化学方法检测各组组织中EPO的表达水平,采用HPIAS1000图文报告管理系统对EPO的表达进行定量分析，并用SPSS13.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：EPO在骨肉瘤组织中呈高表达,EPO在良性骨软骨瘤组织中呈低表达,EPO在骨肉瘤组织中的表达与良性骨软骨瘤组织的表达比较差异有显

2、著性(P<0.05)。结论：EPO在肿瘤的发生发展等过程中起了重要作用。【关键词】骨肉瘤;EPO;免疫组织化学;图像分析;统计分析　骨肉瘤是原发于骨组织的最常见的恶性肿瘤，发病年龄多位于11～20岁，其次为21～30岁。此类肿瘤恶性程度高，常危及患者生命[1]。骨肉瘤发病率占骨肿瘤的20%，占恶性骨肿瘤的76.2%，好发于青少年，易早期肺转移，进展快，预后差。其发生机制不明确[2，3]。　　最近多项研究证实促红细胞生成素(EPOR)在多种原发恶性肿瘤及肿瘤细胞株中表达,可以调节肿瘤细胞的生长发育,引起恶性肿瘤新生血管的生长。EPO转录产物和EPOR蛋白的

3、表达在人肾癌细胞[4],子宫颈癌和卵巢癌等女性生殖系统肿瘤,以及乳腺癌[5]和前庭神经鞘瘤[6]中被证实。目前EPO在肿瘤组织的表达及对肿瘤生长的作用国外仅在肾癌、卵巢癌、乳腺癌等少数肿瘤中有所研究,在骨肉瘤中的表达,国内相关研究报道较少。　　本研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中EPO的表达水平，并进行了统计学分析，探讨EPO在骨肉瘤发生、发展过程中的作用，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1材料及分组　　收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨

4、瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。　　1.1.2材料　　采用免疫组织化学SP法检测EPO在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。　　1.2主要试剂和仪器　　1.2.1主要试剂　　①EPO兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。　　1.2.2主要仪器①YPBS(pH7.4)漂洗3×3min;②抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01MPBS(pH7.4)漂洗5×3min;③滴加3%过氧化氢，37℃湿

5、盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01MPBS(pH7.4)漂洗3×3min;④正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01MPBS(pH7.4)漂洗3×5min;⑥滴加生物素标记的二37℃湿盒孵育10min，0.01MPBS(pH7.4)漂洗3×3min;⑦滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01MPBS(pH7.4)漂洗3×3min;⑧滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5min)，自来水冲洗终止反应;⑨苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸

6、酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。　　1.3.3免疫组织化学结果判断　　EPO阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞膜和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。　　采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对EPO的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率

7、的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。　　1.4统计学处理　　数据以均数±标准差表示，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验，检验水准α为0.05。　　2结果　　在骨肉瘤组中可见密集分布的棕黄色颗粒，EPO表达强;在良性骨软骨瘤组中可见少量的棕黄色颗粒，EPO表达弱或无表达。图像分析结果显示:骨肉瘤组EPO表达的平均光密度为0.3571±0.0097,良性骨软骨瘤组EPO表达的平均光密度为0.0982±0.0043;骨肉瘤组EP