丝蛋白直接诱导无定形磷酸钙生成研究

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1、丝蛋白直接诱导无定形磷酸钙生成研究　　众所周知，骨骼是最复杂的生物矿化系统之一。胶原纤维预先构建有机质，在酸性蛋白的协同作用下，羟基磷灰石晶体（HAP）生成并沿着胶原纤维轴向取向生长，构成骨骼-一种高度有序的有机/无机杂化材料。一般认为，在胶原蛋白的调控下，HAP所产生的复杂精妙且非常有序的多级结构赋予了骨骼优良的机械性能[1].　　　　目前，磷酸钙盐或者以其为基础的杂化体已成为骨修复材料中相当重要的一类。在巨噬细胞/破骨细胞和酸性环境的共同作用下，特定的磷酸钙盐部分溶解，同时Ca2+和PO43-离子被释放到周围微环境，使周围生物流体的

2、过饱和度增大，诱导了HAP及碳酸磷灰石（CHAP）在磷酸钙盐表面的再次沉积[2].通常，理想的骨修复材料应具备有良好的生物降解性以提供Ca2+和PO43-,只有这样，HAP才能够在有机物的诱导下形成高度有序的结构。　　　　单纯的HAP材料被认为是极度生物惰性的，在生物体内几乎不降解，因此，很难将以HAP为基础的材料直接用于骨骼的修复。　　　　与之相比，磷酸三钙（TCP）则具有更好的生物降解性能，因此对于骨修复用双相或多相磷酸钙盐材料，人们往往通过调节其中较稳定相（通常为HAP）和可吸收相（通常为TCP）的比例来控制其总体降解速率[3].

3、但是，HAP的不可降解性仍使此类组分成为了材料中的薄弱环节，进而影响了实用效果。　　　　另一方面，无定形磷酸钙（ACP）是磷酸钙几种晶型中具有良好溶解性及生物降解性的材料，同时也有很好的生物相容性、骨细胞黏附性及骨传导性[4~6].此外，ACP在牙科材料[7]、缓释载体[8,9]等方面也有着广泛的应用。　　　　综合而言，ACP在生物医学方面有着其他晶型的磷酸钙盐无法替代的地位，逐渐成为研究的热点。但是，ACP通常需要保存在干燥的环境中或者通过在混合体系中掺杂来稳定，如P2O47-、CO32-、Mg2+等[4,10]各种正负离子以及柠檬酸

4、盐[11]、三磷酸腺苷（ATP）[12]等有机小分子的加入均能够稳定ACP.　　　　合成高分子如聚电解质[13]能够抑制晶相磷酸钙的生长，且能使获得的ACP具有较小的尺寸和较高的表面带电性。同样，聚乙二醇不仅能够有效地稳定ACP,同时聚合物本身的特性改善了ACP与聚合物的界面性能，为制备性能良好的复合材料提供了可能[14,15].但是合成高分子的生物相容性和生物降解性较差，其与ACP的杂化材料在体内的应用仍有局限性。　　　　丝蛋白（silkfibroin,SF）是桑蚕丝最主要的组成部分，由18种氨基酸组成，与合成高分子相比具有更好的生物

5、相容性及生物降解性[16].肝素化的丝蛋白支架作为骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的缓释载体，能够显着促进人骨肉瘤细胞（MG-63）的分化[17].MG-63细胞同样能在纳米羟基磷灰石/丝蛋白复合支架材料上具有良好的粘附、增殖能力，并可引起早期的骨分化[18].有研究表明，在作为可溶性添加剂调控磷酸钙的结晶生长时，丝蛋白的微观结构对矿化有较大的影响。　　　　丝蛋白在模拟体液中的自组装结构为HAP的结晶生长提供成核位点[19];无规线团/螺旋构象能够诱导形成具有片状结构的二水磷酸氢钙（DCPD），而β-折叠构象则有利于诱导三维多

6、孔的HAP的形成[20].但是，以丝蛋白直接诱导ACP生成的研究却十分有限。　　　　本文希望采用氨气缓慢的扩散和溶解来逐渐提高相应矿化溶液的pH值，以便在减缓磷酸钙盐结晶速率的前提下，有利于我们获得和观察ACP,并结合丝蛋白对所生成磷酸钙的调控作用，通过对矿化时间及浓度等因素的研究，使ACP在特定的条件下可控生成并且具有相应的稳定性。　　　　1实验部分　　　　1.1原料与试剂。　　　　桑蚕（bombyxmori）丝，来自于南通农户；溴化锂（LiBr,上海酷灵精细化工有限公司）；无水碳酸钠（Na2CO3）、无水氯化钙（CaCl2）、十二水

7、磷酸二氢钠（NaH2PO412H2O）、氨水（NH3H2O,25.0%~28.0%）、硝酸（HNO3,65.0%~68.0%）、过氧化氢（H2O2,30%）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；透析袋（再生纤维素，上海绿鸟科技发展有限公司，截留分子量3500和12000~14000）。　　　　1.2丝蛋白溶液的制备。　　　　桑蚕丝脱胶和溶解的具体过程见