带形蜈蚣藻的化学成分研究

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1、带形蜈蚣藻的化学成分研究【摘要】目的研究南海大型经济海藻带形蜈蚣藻(Grateloupiaturuturu)的化学成分。方法利用色谱、红外、质谱和核磁共振波谱等方法对带型蜈蚣藻的化学成分进行分离和结构鉴定并进行抗病毒活性研究。结果从中分离鉴定了6个化合物，分别为棕榈酸(I)、3-β-5-烯-胆甾醇(Ⅱ)、胆甾-4-烯-6-酮(Ⅲ)、胆甾-4-烯-3-酮(Ⅳ)、胆甾-4，6-二烯-3-醇(Ⅴ)和胆甾-4，6-二烯-3-酮(Ⅵ)，化合物Ⅱ抗HSV-1病毒效果较好，其IC50达到7.81μg/ml。结论以上均为首次从该海藻中分离得到。化合物Ⅱ具有较好的抗病毒活性。【关键词】带型蜈蚣藻;

2、化学成分;抗病毒活性;HSV-1　海藻生存在海洋高压、高盐、少光、少氧等特殊的环境中，其次生代谢产物往往具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤方面的活性[1，2]。我国有经济价值的海藻一百多种，主要为褐藻、红藻、绿藻及少量蓝藻等大型种类。南海大型经济海藻带形蜈蚣藻GrateloupiaturuturuYamada属于红藻门、真红藻纲、隐丝藻目、海膜科、蜈蚣藻属[3]。目前已知的蜈蚣藻属海藻有31种，自20世纪50年代就开始对该属海藻进行了化学成分和生物活性方面的研究，从中分离分析出的化合物主要为氨基酸、脂肪酸、甾醇、糖苷等[4～9]。但对带形蜈蚣藻化学成分及生物活性的研究还很少见文献报道[10

3、，11]。本文对带型蜈蚣藻醇提物进行分离分析，并对分离获得的单体化合物进行抗病毒活性研究，希望对深入开发利用海藻资源提供理论依据。　　1材料　　1.1样品带形蜈蚣藻全藻，采集自广东南海南澳岛，由中国科学院海洋研究所夏邦美、丁兰平教授鉴定，现保存在中科院青岛海洋研究所海藻标本室。　　1.2试剂95%乙醇，广州化学试剂厂;柱层析硅胶，薄层层析硅胶(HF254)，青岛海洋化工有限公司;葡萄糖凝胶(SephadexLH-20)，Pharmacia公司;其他试剂均为分析纯。阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)，湖北科益药业股份有限公司;病毒唑(Ribavirininjection)，广州

4、市市桥药业有限公司;DMEM培养液，Hyclone;胎牛血清，Gibco公司产品;其它试剂均为分析纯。　　1.3仪器RE-52CS三用紫外线分析仪，上海嘉鹏科技有限公司;XT-6型熔点测定仪(温度未校正)，北京泰克仪器有限公司;EQUINOX-55型红外光光谱仪，德国BRUKER公司;TraceQC-traceMS型气-质联用仪，美国Finnigan公司;BRUKERDRX-400型核磁共振仪，德国BRUKER公司;AB-ZHS型质谱仪，英国VG公司。酶标仪，美国BIO-RAD公司。　　1.4实验采用的病毒及对应的宿主细胞柯萨奇病毒(CVB3),武汉大学医学院病毒研究所提供;宿主

5、细胞为人宫颈癌HeLa细胞。单纯疱疹病毒I型(HSV-1，F株，美国ATCCVR733);宿主细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero,美国ATCCCCL81)。　　2方法　　2.1样品的提取分离带形蜈蚣藻全藻(干重5kg)。用95%乙醇室温浸提3次。减压浓缩后依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇进行萃取，石油醚层粗提物过常压硅胶柱，石油醚/醋酸乙酯体系梯度洗脱后，石油醚∶醋酸乙酯为9∶1和7∶3部分用常压硅胶柱层析和凝胶柱色谱SephadexLH-20分离纯化，得化合物I、II。石油醚:醋酸乙酯为2∶8洗脱时出现白色晶体，用凝胶柱色谱SephadexLH-20分离纯化，得一混合物。　　2.2抗

6、病毒活性实验　　2.2.1样品母液的配制称取化合物I棕榈酸、化合物II3-β-5-烯-胆甾醇各4mg溶于100μlDMSO和1900μlDMEM中。将上述6样品配成2mg/ml原始液，滤膜除菌，备用。　　2.2.2MTT法测定样品对细胞的毒性将终浓度为2.5×105/ml的细胞接种于96孔细胞培养板上，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞长成单层后，弃去培养液，将样品溶液用维持液对倍稀释成不同浓度，加入96孔板中，每孔加100μl，每个稀释度平行作四孔,置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，继续培养4h后，弃MTT液，每孔加入浓度为1

7、0%的SDS100μl,置于37℃,5%CO2培养箱中，过夜。用酶标仪测OD值(测量波长为570nm,参比波长为630nm),求出样品液对细胞的半毒性浓度(50%cytotoxicconcentration,CC50,μg/ml)和无毒界限浓度(maximalnon-cytotoxicconcentration,MNCC)。细胞存活率%=试验孔OD值/细胞对照孔OD值×100%[12]。　　2.2.3样品对由病毒感染引起细胞病变的抑制作用将终浓度为2.5×105/ml的细胞接种于