疏肝健脾方不同提取工艺对化学性肝损伤的保护作用

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1、疏肝健脾方不同提取工艺对化学性肝损伤的保护作用　　肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，具有发病率高、病程长、难治愈、易反复等特点，严重危害到人们的身体健康。疏肝健脾方(又名肝乐颗粒、肝乐冲剂)依据见肝知脾，知肝传脾，当先实脾理论创制而成，具有疏肝解郁、健脾渗湿、活血化瘀之功效，用于急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化活动期，临床疗效确切。本研究采用一次性腹腔注射0．1%四氯化碳复制肝损伤小鼠模型，观察疏肝健脾方不同提取工艺对其的保护作用。　　1、材料与方法　　1．1试验药物药材源于安徽中医药大学第一附属医院草药房，经孟楣主任中药师鉴定为正品。疏肝健脾方水提物:按照处方比例，精确称取茵

2、陈，板蓝根、薏苡仁等药材重量，加8倍量水煎煮2次，每次1h，合并两次水煎液浓缩成浸膏，备用。疏肝健脾方醇提物:精确称取上述药材，加8倍量80%乙醇煎煮2次，每次1h，减压蒸去乙醇浓缩成浸膏，备用。疏肝健脾方醇水双提物:精确称取上述药材，第一次加8倍量80%乙醇煎煮1小时，过滤煎液;第二次加8倍量水煎煮1小时，过滤煎液，合并两次滤液，浓缩成浸膏，备用，不同提取物浸膏得率如表1所示。　　　联苯双酯:北京协和制药厂产品。　　1．2动物昆明种小鼠，体重20±2g，雄性，由安徽省实验动物中心提供，许可证号:SYKK(皖)2012-002，SPF级。　　1．3试剂四氯化碳(CC

3、l4)，天津市富宇精田化工有限公司;丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)试剂盒，南京建成生物工程研究所;兔抗鼠NF-κB、TNF-α单克隆抗体、DAB显色试剂，河北博海生物工程开发有限公司。　　1．4仪器GL-20A全自动冷冻高速离心机，湖南仪

4、器仪表总厂离心机厂;BIOＲAD680酶标仪，美国伯乐公司。　　1．5方法小鼠适应性饲养一周后，随机分为正常对照组、模型组、疏肝健脾方水提、醇提、醇水双提(15．6g/kg)组和联苯双酯(BP，0．1g/kg)组，每组10只。灌胃给予不同工艺制备的提取物，每天1次，连续10d，正常对照组和模型组给予等量溶媒。末次给药8h后腹腔注射0．1%CCl4橄榄油溶液(10ml/kg)复制化学性肝损伤模型，16小时取样。　　1．5．1肝脏病理组织学观察取固定部位肝组织，置于10%福尔马林液中固定，48h后常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、脱水、透明、封片，普通光学显微镜下观察病理组

5、织学改变。　　1．5．2血清ALT、AST的含量血清ALT、AST含量采用分光光度计法测定，严格按试剂盒说明书的操作步骤进行操作。　　1．5．3肝组织SOD、MDA、GSH-Px的含量取肝脏组织，用冷生理盐水洗去浮血，拭干，称取0．3g肝组织，制成10%的肝匀浆。进行SOD、MDA、GSH-Px含量的测定，具体遵照说明书进行。　　1．5．4肝组织中NF-κB、TNF-α的表达采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，S-P法免疫组织化学染色，用DAB/H2O2显色，苏木精复染。具体操作按试剂盒说明书，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，具体遵照说

6、明书进行。　　2、结果　　2．1疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝脏病理组织学改变的影响HE染色显示，正常组肝细胞结构清晰，肝细胞核大而圆，核膜清晰，核仁明显，胞质丰富;CCl4模型小鼠细胞核断裂，肝细胞呈较广泛的嗜酸性坏死，肝细胞肿胀较明显，脂肪变性，形成空泡;疏肝健脾方各组和BP组均可减轻病变程度与范围，提示对化学性肝损伤小鼠具有一定的保护作用，结果见图1。　　　　2．2疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响CCl4诱导的模型组血清ALT、AST含量明显升高，与正常组相比，差异具有显著性;而给予的疏肝健脾方不同提取物和BP组血清中ALT、AST水平明显得

7、到降低，结果见表2。　　　　2．3疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px水平的影响与正常组相比，CCl4诱导的模型组肝匀浆MDA含量明显升高，而SOD、GSH-Px含量显著降低，给予疏肝健脾方各组干预10d后，可显著降低肝匀浆MDA水平，升高SOD和GSH-Px水平，结果见表3。　　　　2．4疏肝健脾方不同提取物对化学性肝损伤小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α蛋白表达的影响NF-κB和TNF-α蛋白