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1、探讨接种紫外线致弱六钩蚴诱导的免疫保护力 亚洲带绦虫(Taeniaasiatica)感染在我国西部农牧地区存在局部流行,由于其病原体主要通过人生食受感染的猪肝或野猪等动物的内脏进入人体,危害极大。目前,针对亚洲带绦虫感染的预防主要采取综合防治措施,尚未见应用疫苗预防亚洲带绦虫感染的报道。本研究通过观察乳猪接种UV致弱六钩蚴后血清IgG、脾淋巴细胞分泌细胞因子变化及虫卵攻击感染试验,探讨UV致弱六钩蚴诱导的免疫保护力,为应用疫苗预防亚洲带绦虫感染提供理论依据。 材料与方法 1．实验动物20d龄杜洛克
2、长白三元杂交乳猪,11头,购自都匀市种猪繁殖场,经粪检、驱虫和间接血凝试验证明无囊尾蚴感染。 2．亚洲带绦虫采集以口服槟榔、南瓜子法,对贵州省都匀市绦虫病流行区2例已确诊绦虫病患者进行驱虫,剖开孕节子宫,以3000r/min(离心半径13.5cm)离心15min收集虫卵,用生理盐水调节虫卵浓度为15万个/ml。 3．UV致弱六钩蚴制备采用次氯酸钠法孵化六钩蚴,并将六钩蚴收集于培养皿中,置15)紫外灯下30cm处照射10min,调节六钩蚴浓度为2.5104万个/ml。 4．动物免疫取7头免疫乳猪,沿
3、耳缘静脉注射UV致弱六钩蚴悬液2ml/头,第25d加强免疫1次(1ml/头),每次免疫后第10d采血5ml。第35d处理3头,观察肝脏囊尾蚴寄生情况,收集脾脏,做脾淋巴细胞分离培养,其余4头做虫卵攻击感染试验。 5．虫卵攻击感染及实验分组将上述免疫的4头乳猪作为免疫组,未免疫正常乳猪4头作为感染对照组,两组均以灌胃方法感染虫卵15万个/头。于感染第15d和45d分别处理乳猪2头,比较两组肝脏囊尾蚴总数、未成熟囊尾蚴数、成熟囊尾蚴数及退化/钙化的囊尾蚴数,同时计算减虫率。 6．乳猪脾细胞分离培养将上述
4、收集的乳猪脾脏用无菌镊子夹碎,制备无菌细胞悬液,移入无菌试管。另取一只无菌试管,先加淋巴细胞分离液,在缓慢将制备的脾细胞悬液加入试管中,分离液和细胞悬液体积比为1︰2,以1500r/min(离心半径13.5cm)离心20min,吸出单个核细胞层,用PBS洗涤2次,用10%1640细胞培养液重悬,调整细胞浓度至2106/ml。于96孔培养板中加上述脾细胞悬液100μl/孔,免疫组和正常组各6孔。每组取3孔加终浓度为5μg/ml刀豆蛋白A(ConA),另3孔为对照孔不加刺激物,于37℃、5%CO
5、2培养24h,收集上清,-20℃保存备用。 7．血清细胞因子检测以夹心ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清INF-γ和IL-4含量,操作步骤按试剂盒说明书进行,用Biorad450酶标检测仪(美国BioRad公司生产)测450nm处吸光度(A)值。INF-γ和IL-4试剂盒购自浙大生物基因工程有限公司(美国RapidBioLab公司产品,分装)。 8．血清特异性IgG检测猪血清特异IgG含量以夹心ELISA法检测,操作步骤按试剂盒说明书进行,用Biorad450酶标检测仪测45
6、0nm处吸光度(A)值。猪IgG检测ElISA试剂盒购自上海彩佑实业有限公司。 9．统计分析用统计软件Graghpad对观察指标进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1．乳猪接种UV-致弱六钩蚴后的健康状况3头乳猪沿耳缘静脉接种UV-致弱的六钩蚴后体温未见升高,饮食正常。第35d处理乳猪,肝脏未见囊尾蚴寄生。 2．乳猪接种UV-致弱六钩蚴后血清特异性IgG水平乳猪接种UV-致弱六钩蚴第10d和35d,血清特异性IgG含量为(34.4±5.02)mg/ml,与免疫
7、前(13.7±4.37)mg/ml相比差异有统计学意义(t=9.312,P<0.05)。 3．乳猪接种UV-致弱的六钩蚴后脾淋巴细胞分泌细胞因子水平变化脾淋巴细胞体外培养24h后,免疫组上清IL-4含量为(39.65±15.3)pg/ml,与正常对照组(15.8±7.5)mg/ml比较差异有统计学意义(F=10.45,P<0.05);经ConA刺激体外培养24h后,免疫组上清IL-4含量为(156.94±11.81)pg/ml,与正常
8、对照组(80.6±13.5)mg/ml比较差异有统计学意义(F=12.82,P<0.05);脾淋巴细胞体外培养24h后,免疫组上清INF-γ含量与正常对照组含量比较差异无统计学意义(F=2.45,P>0.05),经ConA刺激体外培养24h后,两组INF-γ含量均上升,分别为(416.18±24.62)pg/ml和(327.27±79.34)pg/ml,但差异无统
