小鼠卵透明带zp2抗体的制备及其免疫性分析

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1、小鼠卵透明带ZP2抗体的制备及其免疫性分析　　哺乳动物卵透明带（zonapellucida,ZP）是覆盖于卵母细胞及着床前受精卵外的一层糖蛋白基质。小鼠卵透明带和人类的相似，由ZP1、ZP2、ZP3三种糖蛋白组成。传统观点认为，ZP3是第一精子受体和顶体反应的诱导物，ZP2是第二精子受体参与精卵识别过程，能与顶体反应后的精子结合。因此，早期研究主要集中在ZP3.但是，近几年的研究实验显示ZP2在精卵识别起到很关键的作用。重组人ZP239-154肽段则可抑制人精子与透明带结合[1],小鼠ZP2的35~637肽段能够造成其免疫不育[2].用重组

2、人ZP2肽段免疫猕猴和狒狒，均导致明显的免疫不育效果[3].用在E.coli中表达的重组帽猴ZP蛋白（包括ZP1和ZP2）免疫雌性帽猴，也导致生育率明显降低[4].重组mZP2121-140肽段诱发的抗体能与小鼠卵巢透明带特异结合并降低小鼠的繁殖力[5],说明ZP2在受精过程中其着重要的作用。　　Dean等进一步将人类的ZP1、ZP2、ZP3或ZP4基因导入小鼠，分别得到产生含人ZP1、ZP2、ZP3或ZP4的小鼠透明带嵌合体[1].这种用人的特定ZP蛋白取代小鼠自身ZP蛋白的转基因小鼠实验显示，人类精子只结合嵌入人ZP2的转基因小鼠的透明

3、带，而且，嵌合人ZP2的透明带在受精后仍能保持与精子结合[6].定点突变消除小鼠ZP2的切割位点，该ZP2突变的透明带在受精后能保持与精子的结合[7].说明小鼠ZP2在精卵结合中起关键作用。　　近年来的研究突显ZP2的重要，有待深入研究。我们近年的研究发现，与许多其它动物的透明带相似，小鼠卵泡的颗粒细胞也参与ZP2的发生[8-9].抗体是研究透明带生化特性和功能的重要工具，通过基因工程表达透明带蛋白是制备抗体简便有效的途径，但国内实验室主要探讨表达生产ZP3[10-14],很少研究ZP2.目前还没有报道国内其它实验表达ZP2蛋白，更没有制备

4、抗体。为了对ZP2的功能进行更深入的研究，制备ZP2抗体很必要和迫切。　　1材料与方法　　1.1抗原的制备　　参见文献[15]方法利用Rosetta-gam（iDE3）pLysS菌株体外表达重组小鼠ZP2肽段mZP2201-515,取重组质粒mZP2转化菌和Rosetta宿主菌的超声裂解上清进行SDS-PAGE电泳分离目的蛋白。通过染色对照，从凝胶上切下目的蛋白所在位置的胶条，对照菌裂解上清电泳分离后在对应位置切下胶条，称重，在冰上研钵内研磨直至凝胶为均匀的细小颗粒，再按质量体积比1∶1加入PBS和等体积的弗氏佐剂乳化。首次免疫使用弗式完全

5、佐剂，强化免疫用弗式不完全佐剂。　　1.2免疫方法　　分别用目的蛋白胶和对照胶的乳化抗原通过皮下多点注射途径免疫新西兰雄兔（实验组和对照组）。首次免疫剂量含重组抗原大约lmg.2周后强化免疫，以后每隔1周强化免疫1次，共4次，每次剂量约含重组抗原0.5mg.每次免疫前都从耳缘静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。停止免疫1周后心脏采血分离血清。　　1.3ELISA检测抗血清及其效价　　以分离的重组蛋白为包被抗原包被ELISA板，重组蛋白调整浓度至5μg/孔。ELISA检测兔血清时，实验组和阴性对照组抗血清分别按1∶5000稀释，二抗用

6、1∶10000稀释的羊抗兔IgG-HRP（武汉博士德公司）。以D490值为Y轴，以免疫采血次数为X轴来绘制抗重组抗原的IgG抗体反应曲线。取ELISA检测反应强度最强的末次兔血清按1∶5000~1∶160000稀释6个不同的倍数梯度作为一抗，按1∶10000稀释羊抗兔IgG-HRP作为二抗，测定D490值。　　1.4免疫组化检测抗血清特异性　　将兔抗ZP2血清依次稀释1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶100006个倍数，分别覆盖于小鼠卵巢切片上，对照组切片加对照兔血清，放入湿盒中在37℃放置5h.洗涤后继

7、续孵育CY3标记的羊抗兔IgG（Sigma）。在荧光显微镜下观察卵巢切片的染色情况。　　1.5孕酮诱导精子顶体反应将获能后的小鼠精子分成两组，对照组加入DMSO,实验组加入终浓度为25μmol/L的孕酮（广州明兴制药厂），诱导顶体反应1h.用PBS清洗精子后涂片。用PNA-FITC（Sigma）和Hoches（tSigma）同时对精子的顶体以及精子核进行双标记。在荧光显微镜下观察精子的着色情况。　　1.6精卵结合实验。用PMSG（宁波第二激素厂）和HCG（丽珠药业）对昆明小鼠促排卵，卵母细胞分成两组，对照组卵转移到含对照兔血清的微滴中

8、，实验组卵转移到含有兔抗mZP2抗体的培养微滴中，血清稀释200倍，CO2培养箱中孵育1h后，将两组卵母细胞分别移入新的M2培养液中以洗去卵子上残余的抗体。分别加入诱导顶体反应后