受精前后卵透明带糖蛋白的生化特性差异

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1、华南理工大学学报（自然科学版）第31卷第11期JournaIofSouthChinaUniversityofTechnoIogyVoI.31No.112003年11月（NaturaIScienceEdition）November2003文章编号：1000-565X（2003）11-0069-04!受精前后卵透明带糖蛋白的生化特性差异曹佐武（暨南大学生殖免疫研究中心，广东广州510632）摘要：探讨受精后卵透明带糖蛋白的生化特性变化.用SDS-PAGE分析未受精卵和2-细胞胚胎的透明带成分的差异.研究结果表明，受精前后卵透明带的主要带型相似，但2-细胞胚胎透

2、明带在还原电泳中有一条特异的小肽，分子质量在15000~30000之间，约为22000.进一步用HPLC分析两种样品的0-侧糖链的不同，分析显示，两种样品的0-糖链中有3种单糖基的保留时间值很相似，但有些寡糖基明显不同.小鼠透明带精子受体失活的分子机制主要在于0-寡糖链的修饰，0-单糖与精子受体失活没有明显的关系.关键词：透明带；0-糖链；糖蛋白；生化特性中图分类号：O26文献标识码：A受精是精子与卵细胞特异性识别并融合形成受是作为精子受体的ZP3糖链被修饰造成的.但是带精卵的过程.精子与卵细胞识别的关键在于精子膜反应中ZP3被如何修饰呢？目前尚无明确的答

3、案.蛋白与卵透明带之间的结构特异性，是一种受体与文中通过比较未受精卵和2-细胞期胚胎的透明带配体的特异性结合.成分差异来探讨带反应对透明带的修饰.透明带是卵细胞膜外的一层特殊的非细胞结1材料和方法构.小鼠和其它研究过的哺乳类的透明带都是由少数几种糖蛋白组成，小鼠透明带糖蛋白成分有3种，1.1主要材料［1］分别命名为ZP1、ZP2和ZP3.研究显示，小鼠透明孕马血清促腺激素（PMSG）购自长春军事兽医带糖蛋白ZP3在受精中充当初级精子受体，ZP2充研究所；人绒毛膜促腺激素（HCG），南京大学制药当次级精子受体.ZP3上的精子受体活性归因于糖厂生产；透明质酸酶

4、、牛血清白蛋白质均为Sigma产［2，3］蛋白上特异的0-糖链.品；昆明小鼠购自暨南大学实验动物所.受精后精子激发卵细胞发生一系列变化，其中1.2促排卵皮质颗粒释放多种水解酶并排出卵细胞外，这些酶18~22g的雌性昆明小鼠，腹腔注射5!moI/min渗透到透明带中使透明带结构发生变化，阻止后来的PMSG，48h后腹腔注射5!moI/min的HCG.注射的精子结合和穿透透明带发生多精子受精.［4］HCG后的特定时间取小鼠输卵管，在生理溶液M2中研究表明，受精后透明带糖蛋白ZP1二聚体取卵母细胞卵丘细胞团（0CC）.卵母细胞的卵龄指注变成单体，ZP2发生有限水

5、解，但作为精子初级受射HCG后至杀鼠取卵间的时间.体的ZP3分子质量没有明显变化，而精子受体活性注射HCG后，另一部分促排卵雌鼠与雄鼠合消失，推断这种失活不是由于ZP3被蛋白裂解，而笼，第三日取交配成功的雌鼠输卵管收集胚胎，收集小鼠2-细胞期胚胎，用M2洗涤胚胎后制备其透明带成分.收稿日期：2003-03-04!基金项目：广东省自然科学基金资助项目（010398）1.3制备小鼠未受精卵和2-细胞期胚胎的作者简介：曹佐武（1963-），男，博士，副研究员，主要透明带从事生殖科学和分子生物学研究.将去除卵丘颗粒细胞并洗干净的卵子用微细吸70华南理工大学学报（自

6、然科学版）第31卷管转入约50!L的稀乳酸（pH2.5）中，显微镜下见透明带逐渐溶解，小心转移裸卵，收集透明带溶解液，汇集于小Eppendorff管中.同样用稀乳酸溶液（pH2.5）溶解2-细胞期胚胎的透明带.离心除去遗留细胞及碎片后，透明带溶解液加入透析袋中，在10C低温冷柜中透析过夜，中间换水3次，透析后的透明带溶解液在冷冻干燥机中冻干备用.1.4SDS-PAGE分别用去离子水溶解170个成熟未受精卵的透明带成分，用去离子水溶解390个2-细胞胚胎的透明带成分.取10!L样品与10!L含2%巯基乙醇的样品缓冲液1I1混匀，100C水浴中变性5min，图

7、1几种透明带样品的电泳图进行还原电泳.Fig.1SDS-PAGEofseveraIzonapeIIucidasampIes配制15%的SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩1—蛋白质标准品；2—还原处理的卵透明带样品；胶，用MiniproteanII系统（Bio-Rad）灌胶.取约203—还原处理的2-细胞胚胎透明带样品!L的透明带样品点于凝胶的既定的点样孔中，在蛋在还原条件下，胚胎透明带与未受精卵透明带白质微量电泳仪（Bio-Rad）中于20mA恒流电泳约相比，各种蛋白质成分的分子质量没有明显变化，透45min，溴酚蓝接近凝胶的下缘.明带糖蛋白的各种成分的分

8、子质量较均一，条带较1.5用稀碱剥离透明带成分的0-侧糖链细而清晰