hsv1糖蛋白b基因疫苗体内表达的观察

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1、HSV1糖蛋白B基因疫苗体内表达的观察【关键词】单纯疱疹病毒1型;糖蛋白B;基因疫苗;免疫组化单纯疱疹病毒1型(HSV1)感染眼部主要引起单纯疱疹病毒性角膜炎、急性视网膜坏死、虹膜角膜内皮综合征等。其中单纯疱疹病毒性角膜炎是当今世界上一种常见的主要致盲性眼病，近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用，其发病率有明显上升趋势，但其发病机制、治疗方法及HSV1的潜伏形式、部位等，一直是眼科界棘手的问题。许多学者认为针对病毒的特异性自动免疫是控制HSV1感染的最有效途径，因此HSV1疫苗是治疗和预防单纯疱疹病毒感染的重要研究方向。本

2、研究利用已构建成功的HSV1糖蛋白B基因疫苗(pgB)〔1〕进行免疫，初步观察其在动物体内的表达情况，为应用pgB进行治疗和预防HSV1在眼部感染奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料HSV1SM44株购自中国药检所疫苗三室，-70℃保存，病毒滴度TCID50107.5/ml;Vero细胞由长春生物制品所程晓庚教授惠赠;DMEM培养基、15%胎牛血清、大肠杆菌DH5α及真核表达质粒pcDNA3(吉林大学第一医院中心研究室提供);重组真核表达质粒pgB由本研究的前期工作制备〔1〕。健康BALB/c小鼠(购自吉林大学基础医学院动物

3、实验室)，雌性，体重(18±2)g，4～6l/L小牛血清的DMEM培养基中，单层细胞形成后，接种HSV1SM44病毒原液5μl(TCID50107.5/ml)，病毒维持液含10ml/L小牛血清的DMEM，37℃培养。待细胞病理改变达到60%左右时，收获病毒，并离心(2000r/min，5min)，用上清检测TCID50和PFΜ后标明，-70℃冻存备用〔2〕。　　1.2.2质粒的大量提取将转化有pgB及pcDNA3的大肠杆菌分别划板，在37℃恒温箱内过夜。挑取单菌落，置于150mlLB液体培养基中，140r/min、37℃过夜。质粒的

4、提取严格按照无内毒素型质粒DNA大量纯化试剂盒(Vitagene)的说明书进行操作。将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测OD260/OD280和OD260。　　1.2.3质粒的内毒素检测提纯的质粒pgB和pcDNA3定量分析后，分别取出25μg用无菌PBS稀释到50μl，再与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化，鲎试剂检测有无凝集反应。　　1.2.4免疫小鼠〔3〕BALB/c小鼠随机分为4组，每组30只：A组(实验组)注射含pgB的PBS溶液;B组(阳性组)注射紫外线灭活的病毒液(UVHSV);C组(载体对照组)

5、注射含pcDNA3的PBS溶液;D组(空白对照)只注射无菌PBS(pH7.4)溶液。　　选取肌肉接种的方法。将小鼠双侧大腿内侧肌群用750ml/L酒精消毒，注射无菌PBS稀释的布比卡因(1.5mg/ml)每侧100μl。3d后进行同部位的多点注射免疫接种：每只鼠每次接种100μg质粒(溶于0.2ml无菌PBS溶液)，质粒与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化。间隔3，放于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜。切片用于视网膜VEGF免疫组织化学染色(SP法)检测。显微镜下观察并照相。　　2结果　　2.

6、1质粒大量提取结果为免疫小鼠而大量提取的质粒pcDNA3及pgB，经紫外分光光度仪测得OD260/OD280分别为1.8128及1.9034。经鲎试剂检测无凝集反应。　　2.2pgB在小鼠体内表达的观察免疫组化结果示：实验组与阳性组结果一致，免疫后第2、4、6周免疫组化结果均可见HSV1gB蛋白在视网膜、三叉神经节、脑组织中持续表达，大部分细胞核呈棕黄色，免疫组化呈阳性结果(见图1)，说明接种重组质粒pgB后，pgB在小鼠体内能表达HSV1gB蛋白。而载体对照组和空白对照组同阴性结果一致，未见视网膜、三叉神经节、脑组织细胞呈棕黄色

7、改变(见图2)，免疫组化结果为阴性。　　3讨论　　HSV1是双链线性DNA病毒，其感染在全世界非常普遍，不仅可产生原发性感染，而且还能产生潜伏感染和复发性感染。人群中约有90%以上的人曾感染过HSV1，其危害已引起人们的广泛重视。HSV1是引起病毒性角膜炎、病毒性脑膜炎、口唇生殖器黏膜和新生儿感染的主要病原体。近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用和滥用，使HSV1感染具有明显上升的趋势。　　根据感染特点，可将HSV1疫苗分为抗原发性感染的预防性疫苗和抗复发性感染的治疗性疫苗。HSV1疫苗按其特点和作用机制可分为灭活病毒疫

8、苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗和核酸(基因)疫苗〔7〕。基因疫苗是近十几年才发展起来的一项新的生物技术，其作为第三代疫苗的地位已得到了确认。基因在体内的表达及诱生免疫反应的过程，模拟了自然状态下机体感染外